应用改进的AdEasy系统制备重组腺病毒

目的改进AdEasy系统,使之更简便、高效、快捷。方法pAdtrack经酶切线性化后,转化经氯化钙处理的感受态AdEasier-1细菌,获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。荧光显微镜下细胞中重组腺病毒观察绿色荧光蛋白的表达。结果应用氯化钙法由pAdtrack转化AdEasier-1细菌,可获得极高比例的(20/20)阳性重组腺病毒克隆。结论应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统,方法更简便、成功率更高、实验周期更短、对实验室的条件要求低。

应用腺病毒载体系统将HBV／C全基因组转导入HepG2细胞的方法学研究

目的运用腺病毒系统将HBV/C全基因组高效地导入肝癌细胞系,为研究HBV的复制及蛋白表达情况构建技术平台。方法构建HBV/C基因型毒株的1.3拷贝全基因序列,运用腺病毒系统(AdEasy),首先将1.3拷贝HBV全基因序列插入到穿梭载体pAdTrack,经测序证实插入序列的正确性后用PmeI酶切线性化重组穿梭质粒,转化Adeasier-1感受态细胞,在细菌细胞内发生同源重组,所得重组腺病毒质粒pAdEasy-HBV/C用PacI酶切线性化,用脂质体法转染293细胞来包装重组病毒。用适量感染复数的重组腺病毒感染HepG2细胞,并对感染细胞上清中的HBVDNA、HBeAg和HBsAg分别进行了定量检测。结果成功运用腺病毒系统将1.3拷贝HBV全基因组高效率地导入HepG2细胞,导入的HBV能够运用自身的复制调控元件进行病毒的复制和蛋白表达。结论运用AdEasy系统能够简便、快速、高效地将HBV全基因组导入肝癌细胞系,为抗病毒药物的筛选及评价提供了有效的技术平台。

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建及制备

目的构建小鼠T-bet基因重组腺病毒。方法采用RT-PCR方法从小鼠脾脏活化的T淋巴细胞中扩增的cD-NA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒,酶切线性化后,与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-l以电穿孔的方法共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经酶切鉴定筛选正确重组子,以线性化重组质粒转染293细胞,制备重组腺病毒小鼠T-bet重组腺病毒AdT-bet,最后以PCR及Western blot方法鉴定T-bet的表达。结果感受态大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组24h后共获得35%阳性重组质粒克隆,经酶切获得一个30kb的大片段和一个4.5kb的小片断。该质粒转染293细胞后获得的重组腺病毒可高效表达T-bet,纯化后病毒滴度为2.0×1011PFU/mL。结论应用细菌内同源重组法成功快捷构建了含小鼠T-bet基因的重组腺病毒,所获得的AdT-bet可进一步应用支气管哮喘等疾病的基因治疗研究。

高效化学转化菌内同源重组法构建重组腺病毒

目的:对细菌内同源重组法构建重组腺病毒AdEasy系统加以改进,为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定基础。方法:将自杀基因CD和HSV-TK插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,PmeⅠ酶切后,用酚∶氯仿抽提、乙醇沉淀或切胶回收纯化;分别采用电穿孔转化法和化学转化法将线性穿梭质粒(pAdTrackCMV-CDglyTK)与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内实现同源重组;将重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP-CDglyTK以脂质体介导至293细胞中进行包装、扩增。结果:采用切胶回收化学转化法获得阳性重组率最高(100%)。经PCR、酶切以及测序等方法鉴定,证实融合自杀基因已成功插入腺病毒中。结论:对细菌内同源重组法构建重组腺病毒的方法进行了改进,在降低实验成本的同时获得了较原法更高的阳性重组率,并成功构建了复制缺陷性重组腺病毒rAd-CDglyTK。

人骨保护素基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带hOPG基因的重组腺病毒AdEasy-PAdtrack-CMV-hOPG,将重组腺病毒AdhOPG对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs) 进行感染。采用PCR方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度。结果酶切鉴定及PCR结果证明hOPG基因重组腺病毒载体成功, 病毒滴度可达2．5×108pfu／ml,具有很强感染能力,结论应用细菌内同源重组法,成功构建了含 hOPG重组腺病毒载体。

miRNA-30a／30e腺病毒表达载体的构建

目的构建稳定表达成熟miRNA-30a和miRNA-30e腺病毒表达载体。方法小鼠基因组中分别扩增出带有酶切位点的mmu-miR-30a、mmu-miR-30e目的基因,目的基因连接到穿梭质粒pSES-HUS,带有目的基因的穿梭质粒重组到骨架质粒AdEasy1上,重组质粒转染到Hek-293细胞中包装成腺病毒载体,反复扩增之后获得高滴度的pAd-mmu-miR-30a、pAd-mmu-miR-30e腺病毒。用目的腺病毒分3组(RFP对照组,miR-30a组,miR-30e组)感染小鼠Mefs细胞,用荧光定量PCR方法检测mmu-miR-30a、mmu-miR-30e表达情况。结果分别扩增出带有酶切位点的357 bp mmu-miR-30a,324 bp mmu-miR-30e,并成功连接到pSES-HUS上,进一步与AdEasy1重组,包装得到腺病毒表达载体,通过荧光定量PCR检测,Mefs细胞中mmu-miR-30a升高26.46±7.46倍,mmu-miR-30e升高2.76±0.25倍。结论成功构建了成熟miRNA的腺病毒表达载体。

包装信号可以被Cre重组酶切除的辅助性腺病毒的构建及鉴定

目的:为了探索构建第三代复制依赖性腺病毒载体系统的有效实验方法,利用细菌内重组原理,分别构建了第三代腺病毒生产体系中的辅助性腺病毒和表达Cre重组酶的真核表达载体,并分析了Cre切除辅助病毒包装信号的有效性。方法:通过PCR及酶处理法依次将2个同向的loxP位点及绿色荧光蛋白表达盒克隆至pShuttle穿梭载体质粒,按照AdEasy系统的标准实验方法产生和扩增辅助病毒;同时构建pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,并用该载体经脂质体法转染HEK293细胞,通过PCR和流式细胞术分析转染细胞内表达的Cre重组酶对随后感染的辅助病毒的包装信号的切除作用。结果:构建的辅助性腺病毒能够在HEK293细胞内扩增,其包装信号可以由细胞内表达的Cre重组酶有效切除。结论:构建了辅助性腺病毒和pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,为第三代腺病毒的生产奠定了实验基础。

复制型HBV重组腺病毒的制备

目的 通过细菌体内同源重组方法，构建含1．3拷贝HBV DNA片段（HBV4．1）的HBV复制型重组腺病毒。方法从质粒pTh—HBV4．1上获取HBV4．1片段，插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack—CMV中，构建含HBV4．1的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV／HBV4．1。然后在大肠杆菌BJ5183内与pAdEasy—1进行同源重组。形成重组腺病毒质粒pAd—GFP／HBV4．1，经脂质体2000转染HEK293细胞进行包装和扩增，获得腺病毒Ad-GFP／HBV4．1。通过荧光显微镜下观察GFP绿色荧光蛋白的表达，检测腺病毒滴度和感染效率；采用PCR法检测腺病毒DNA上有无HBV基因组存在。结果经酶切鉴定确认含HBV穿梭质粒pAdTrack—CMV／HBV4．1扣重组腺病毒基因组质粒pad—GFP／HBV4．1构建成功；GFP荧光检测提示重组腺病毒Ad-GFP／HBV4．1已成功包装；PCR扩增表明重组腺病毒内携带有HBVDNA片段。在HEK293细胞中获得的病毒滴度可达（4．2—4．8）×10^7 efu／ml；当MOI为100时，感染HEK293细胞的效率〉90％。结论成功构建了携带1．3拷贝HBV基因组的重组腺病毒Ad-GFP／HBV4．1，为进一步建立高水平HBV复制型细胞和动物模型以用于HBV生物学特性的研究奠定了基础。

重组腺病毒方法的改建

目的对构建重组腺病毒的AdEasy载体系统的操作过程予以改进,使其更加简便、高效。方法将腺病毒骨架载体pAdEasy-1用电穿孔法转化大肠埃希菌BJ5183,获得含pAdEasy-1的大肠埃希菌BJ5183/p菌株。氯化钙法制备大肠埃希菌BJ5183/p感受态细胞,并转化含绿色荧光蛋白的穿梭载体,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。以限制性内切酶PacⅠ酶切,得到重组腺病毒DNA分子,转染293细胞。结果293细胞出现细胞病变,荧光显微镜观察有绿色荧光。结论成功获得一种以AdEasy系统为基础的简便、高效构建重组腺病毒的新方法。

CARP基因重组腺病毒载体的构建

目的 :利用Adeasy 1系统 ,构建并鉴定CARP基因重组腺病毒载体。方法 :PCR扩增含有CARP全长cDNA的片段 ,经测序验证无误后 ,亚克隆至pAdTrack CMV穿梭质粒 ,再与pAdEasy 1质粒在大肠杆菌BJ5 183中进行同源重组产生腺病毒载体质粒。经过抗性筛选以及酶切鉴定得到阳性的重组质粒 ,再在 2 93细胞中进行包装扩增 ,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达。结果 :测序证实PCR产物为CARP全长cDNA ;抗性筛选及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功 ;转染 2 93细胞 3天后可见绿色荧光 ,回收病毒可以重复感染 2 93细胞 。

腺病毒介导c-FLIPs基因诱导淋巴细胞抗凋亡作用

目的 探讨表达c FLIPs重组腺病毒诱导淋巴细胞抗凋亡作用。方法 采用RT PCR方法,从人T淋巴细胞株的总RNA中克隆c FLIPs基因;通过pAdeasy系统,构建表达c FLIPs的重组腺病毒Ad c FLIPs;Hochest染色法及PI染色流式细胞仪检测anti Apo 1诱导感染Ad c FLIPs后的H9细胞凋亡。结果 采用RT PCR方法从人T淋巴细胞株中扩增出c FLIPs基因;构建重组腺病毒Ad c FLIPs ;经Hoechst染色,荧光显微镜下观察细胞核的形态,结果发现,经anti Apo 1诱导凋亡处理2 4h后,未经Ad c FLIPs感染的H9细胞有大量的细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞;Ad c FLIPs感染的H9细胞中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀低强度荧光;流式细胞仪分析经PI染色后的H9细胞,未经Ad c FLIPs预处理的H9细胞在anti Apo 1作用2 4h后,细胞的凋亡率分别为4 8 33%±7 4 1% ;经Ad c FLIPs预处理1d的H9细胞,其细胞凋亡率分别下降到3 6 0 %±0 2 1%。结论 重组腺病毒Ad c FLIPs可有效地诱导淋巴细胞的抗凋亡作用。

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:为进一步研究脑红蛋白(NGB)的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体,应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒表达载体,并对其进行鉴定。方法:用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入B J5183细菌,制备B J5183-pAdEasy-1细菌,再以后者作为电感受态细菌,与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB,转染293细胞,制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果:通过PCR、序列测定和W estern印迹杂交鉴定,确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论:成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体,为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。

水痘带状疱疹病毒重组腺病毒载体疫苗的构建及评价

目的构建表达水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)gE抗原的重组腺病毒载体疫苗,并对其免疫原性进行评价。方法采用AdEasy系统构建携带gE基因的重组腺病毒质粒pAdEasy-gE,PCR及Western blot法鉴定AD293细胞系包装的重组腺病毒rAd-gE,采用阴离子和复合介质Capto Core 700两步法对其进行纯化。以3. 3×10~6、1×10~7、3×10~7ifu剂量的rAd-gE分别单针肌内注射免疫NIH小鼠,检测小鼠血清抗体滴度。结果 PCR及PacⅠ酶切鉴定表明,携带gE基因的pAdEasy-gE构建成功;PCR及Western blot分析显示,AD293细胞系成功包装可表达gE糖蛋白的rAd-gE;经两步法纯化,可回收18. 2%的rAd-gE。1×10~7和3×10~7 ifu剂量的rAd-gE可引起小鼠的体液免疫响应。结论已成功构建表达高度糖基化gE糖蛋白的rAd-gE,可有效引起小鼠的体液免疫响应,为VZV新型重组腺病毒疫苗的进一步研发奠定基础。