小鼠SIGIRR基因重组腺病毒的构建及鉴定

拟构建小鼠SIGIRR基因重组腺病毒并进行鉴定,为SIGIRR在小鼠急性肺损伤预防及治疗方面的研究提供基础。利用AdEasyTM系统构建SIGIRR基因重组腺病毒,并检测SIGIRR mRNA及蛋白在感染细胞及组织中的表达。通过多次扩增后,大量制备高滴度腺病毒。结果表明,本试验成功构建了携带小鼠源性SIGIRR基因的重组腺病毒表达载体Ad-mSIGIRR,病毒感染滴度为5×1010 pfu/mL,滴度符合下一步试验要求。Western blot和免疫组化方法分别检测到mSIGIRR在体内的高效表达,且经气管滴注感染小鼠后,不会引起正常小鼠肺组织发生病理变化。明确了SIGIRR基因的重组腺病毒可以在小鼠活体内使mSIGIRR过表达,且经气管滴注5×109pfu的病毒感染小鼠后,不会引起正常小鼠肺组织发生病理变化。

NME1重组腺病毒构建及表达鉴定

目的应用AdEasyTM腺病毒载体系统构建含人NME1基因的重组腺病毒,检测NME1基因在肺癌细胞的表达。方法从人肝脏标本克隆带有KpnⅠ,XhoⅠ双酶切位点的NME1cDNA,利用细菌体内同源重组法将NME1正向连接至腺病毒载体上,测序鉴定正确后,于QBI-293A细胞中包装扩增,TCID50法检测重组腺病毒滴度,重组腺病毒转染至肺癌细胞GLC-82,检测NME1在细胞内表达。结果肝脏组织克隆出470bp条带,测序与NME1编码序列相符,测得重组腺病毒滴度为1010TCID50/mL,免疫实验显示NME1在GLC-82细胞成功表达。结论成功构建含人NME1基因的重组腺病毒并转染肺癌细胞,检测到NME1在肺癌细胞中正常表达。