TAT-E4orf4融合蛋白对胃癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的分析TAT-E4orf4融合蛋白对胃癌AGS细胞凋亡的影响及其作用机制。方法PCR法构建pET28-his-TAT-E4orf4表达载体,经PCR酶切鉴定后,诱导表达。并分别用pET28、pET28-his-E4orf4和pET28-his-TAT-E4orf4处理胃癌AGS细胞,分别采用MTT法和Transwell小室检测TAT-E4orf4对胃癌细胞增殖和迁移的影响,以流式细胞仪检测刺激后胃癌细胞的凋亡,以Western blot检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)和酪氨酸激酶(Src)信号轴上关键蛋白表达的变化。结果PCR和Western blot实验结果证实成功构建pET28-TAT-E4orf4表达载体,MTT法显示pET28-his-E4orf4和pET28-his-TAT-E4orf4刺激后,胃癌AGS细胞增殖活性较空白对照组(1.01±0.12)分别下降至(0.69±0.44)和(0.41±0.06),且后者下降更为明显(P<0.05)。与MTT实验结果趋势相似,Transwell实验的结果,pET28-his-TAT-E4orf4刺激后胃癌细胞迁移数目显著减少到(163.21±36.77)个,与Blank组(796.48±114.35)个、pET28组(803.71±127.39)个、pET28-his-E4orf4组(287.06±78.51)个比较,差异具有统计学意义(P均<0.05)。流式细胞术检测结果显示,TAT-E4orf4融合蛋白干预后,AGS细胞凋亡率显著增加(33.40%),与Blank组(6.28%)、pET28组(8.40%)、pET28-his-E4orf4组(20.50%)比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot实验结果表明,Caspase-3和Caspase-9的表达水平无明显变化(P>0.05),而Src-ERK-AKT信号轴相关蛋白的表达在TAT-E4orf4融合蛋白干预后出现明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论TAT-E4orf4融合蛋白能抑制胃癌细胞增殖和迁移,促进胃癌细胞凋亡,与Caspase途径无关,主要依赖对Src-ERK-AKT信号通路的调控。

靶向性抗肿瘤融合蛋白-表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第4编码蛋白在细胞内的转运及对胞外信号调节激酶磷酸化的影响

目的探讨经表皮生长因子受体介导进入肿瘤细胞的融合蛋白表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第4编码蛋白(EGF-E4orf4)在细胞内的转运及对胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响。方法采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在MDA-MB-231和BGC823细胞中的转运和代谢特点,Western blot检测融合蛋白引起的细胞内ERK磷酸化水平的改变。结果融合蛋白可在细胞内累积,向细胞核周围聚集,并与细胞早期内体和晚期溶酶体共定位;融合蛋白能快速触发细胞内ERK发生磷酸化,磷酸化水平在10 min时最强,之后逐渐回落至刺激前水平,活化ERK的能力较表皮生长因子弱。结论融合蛋白EGF-E4orf4在细胞内经内体-溶酶体途径发生缓慢降解;在MDA-MB-231和BGC823细胞中,融合蛋白的作用特点存在明显差异,可能是导致融合蛋白对二者抑瘤率不同的原因之一。

36型人腺病毒E4ORF1真核表达载体的构建及其促进前脂肪细胞3T3-L1对葡萄糖利用的作用初探

目的通过构建早期基因4开放读码框1(E4ORF1)真核表达载体,探讨E4ORF1蛋白调节前脂肪细胞3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)利用葡萄糖的作用。方法通过分子克隆技术构建pcDNA3.1-E4ORF1重组质粒,并进行DNA测序鉴定。将前脂肪细胞3T3-L1分为对照组和E4ORF1转染组,检测两组细胞第0、1、2、3天培养基中葡萄糖浓度,利用RT-qPCR和Western-Blot检测两组细胞第0、1、2、3、4天E4ORF1、己糖激酶2(HK2)、糖原合酶1(GYS1)mRNA和蛋白质的表达情况。油红O染色观察两组细胞第0、1、2、3、4天分化及脂质积累情况,检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白a(C/EBPa)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA和蛋白质的表达情况。结果成功构建N端带FLAG(DYKDDDDK肽)标签的真核表达载体pcDNA3.1-E4ORF1。与对照组相比,E4ORF1转染组细胞培养基中葡萄糖浓度随培养时间延长下降更快,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-qPCR和Western-Blot结果显示,与对照组相比,转染组E4ORF1的mRNA和蛋白表达水平均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。E4ORF1转染组的糖酵解关键酶基因HK2和糖原合酶基因GYS1 mRNA和蛋白质的表达均显著上升(P均<0.05)。油红O染色显示两组细胞均无成脂分化现象,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPa、FABP4、FASN、ACC的mRNA和蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。结论成功构建pcDNA3.1-E4ORF1真核表达载体;在前脂肪细胞3T3-L1中,E4ORF1可能通过促进HK2和GYS1的表达,参与细胞对葡萄糖的分解和糖原合成过程,对前脂肪细胞的分化无影响。

重组靶向性抗肿瘤融合蛋白EGF-E4orf4毕赤酵母工程菌中试发酵工艺的建立

目的建立重组靶向性抗肿瘤融合蛋白EGF-E4orf4毕赤酵母工程菌的中试发酵工艺。方法优化EGF-E4orf4工程菌二级种子培养时间,按5%的比例接种于20 L发酵培养基,设定培养阶段温度为30℃,诱导表达阶段温度为28℃,在发酵过程中通过调节搅拌速度、通气量和罐压等措施使DO维持在20%～35%,采用三步发酵法进行发酵,优化诱导pH值及诱导时间,并在已优化的工艺条件下,稳定发酵3批。结果确定二级种子的培养时间为15 h,最适诱导pH值为6.0,最适诱导时间为48 h;中试发酵3批,菌体A600均值达(327.67±17.96),菌体湿重均值达(308.33±9.07)g/L,EGF-E4orf4表达量均值为(200.00±5.57)mg/L。结论已初步建立了重组EGF-E4orf4毕赤酵母工程菌的中试发酵工艺,为EGF-E4orf4的产业化奠定了基础。

病毒中具有抗肿瘤作用的编码蛋白

溶瘤病毒可以选择性地诱导肿瘤细胞死亡,除病毒的大量复制、突破细胞膜而直接破坏肿瘤细胞以外,病毒产生的某些特殊蛋白也具有一定的抗肿瘤活性,如腺病毒编码的E4orf4、自主性细小病毒NS1、鸡贫血病毒编码的凋亡素(apoptin)等。不同的病毒编码蛋白所具有的抗肿瘤作用机制不尽相同。进一步了解具有抗肿瘤活性的病毒蛋白的作用机制及特点有助于开发新的抗肿瘤药物。文中就病毒编码蛋白的抗肿瘤作用机制、特点及相关进展作一综述。