肝细胞肝癌靶向性r-Caspase-3重组腺病毒的构建与表达

目的构建肝细胞肝癌特异性表达反向半胱氨酸蛋白酶3(r-Caspase-3)重组腺病毒,为肝细胞肝癌的基因治疗提供新策略。方法构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白(ALB)启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),然后将目的基因r-Caspase-3亚克隆到载体pAdTrack-EAFP-PALB上,获得重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3,经PmeⅠ酶切线性化后与pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒骨架pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3;鉴定正确的pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3经PacⅠ酶切线性化后脂质体转染AD293细胞进行包装、扩增,获得病毒。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率;RT-PCR和West-ernblot法检测r-Caspase-3在HepG2细胞中的表达;SRB染色法评估重组腺病毒对HepG2细胞的抑制作用,初步观察HepG2细胞凋亡状况。结果穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3酶切、测序正确。穿梭载体、pAdEasy-1载体同源重组后PCR及PacⅠ酶切鉴定结果表明pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3重组成功;经PacⅠ酶切线性化后,pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3转染AD293细胞即可观察到GFP的表达;回收病毒可重复感染AD293细胞,RT-PCR和Western blot均可检测到r-Caspase-3的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3病毒颗粒包装成功;SRB染色检测发现Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有凋亡诱导特异性。结论靶向性Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3重组腺病毒构建成功,并具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-Caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能奠定了基础。

MEG3和腺苷对HepG2细胞自噬和增殖的影响

目的:研究母系表达基因3(MEG3)过表达和腺苷对人肝细胞癌HepG2细胞自噬和增殖的影响,并探讨MEG3和腺苷影响HepG2细胞自噬的可能机制和抑制细胞增殖的效果。方法:常规培养HepG2细胞,分为对照组、MEG3组(MEG3慢病毒转染)、腺苷组(1 mmol/L腺苷处理)和MEG3+腺苷组(腺苷组中加入MEG3慢病毒转染)。Western blot检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等蛋白的表达,MDC染色观察自噬体数量,CCK-8法观察细胞的活力,细胞计数仪检测活细胞数量。结果:与对照组比较,MEG3组和腺苷组中HepG2细胞内LC3-Ⅱ减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,mTOR表达增加,HepG2细胞的活力降低(P<0.05),自噬体减少。与MEG3组和腺苷组比较,MEG3+腺苷组中HepG2细胞内LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值进一步降低,mTOR表达进一步增加,HepG2细胞的活力进一步降低,自噬体减少更加显著(P<0.05或P<0.01)。MEG3组和腺苷组中HepG2活细胞数在24～72 h较对照组均明显降低(P<0.01),在MEG3+腺苷组中降低更为明显(P<0.01)。结论:MEG3过表达和低浓度腺苷可激活mTOR通路,抑制HepG2细胞自噬和增殖。MEG3增强了腺苷对HepG2细胞的作用。

重组腺病毒r-caspase3的靶向性实验研究

目的:观察构建靶向性反向半胱氨酸蛋白酶3(r-caspase3)重组腺病毒对AFP表达阳性肝癌细胞凋亡诱导的效果和特异性。方法:采用AFP表达强阳性细胞HepG2、表达弱阳性细胞7721、正常肝细胞L-02以及AFP表达阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,分别感染构建之重组腺病毒Ad-r-caspase3、Ad-EAFPPALB/r-caspase3及Ad-PALB/r-caspase3,SRB染色测定O.D值,计算细胞死亡率和IC50;流式细胞术检测细胞凋亡指数。结果:HepG2、7721细胞对各腺病毒敏感程度为Ad-EAFPPALB/r-caspase3>Ad-PALB/r-caspase3>Ad-r-caspase3;流式细胞术检测结果显示重组腺病毒Ad-EAFPPALB/r-caspase3具有极强的凋亡选择性,AFP表达越强,凋亡指数越高。结论:靶向性Ad-EAFP-PALB/r-caspase3重组腺病毒具有肝细胞性肝癌凋亡选择性,同AFP表达呈正相关。

腺病毒介导microRNA-99a过表达抑制肝癌细胞生长

目的:利用腺病毒介导microrRNA-99a(miR-99a)的过表达,观察miR-99a对肝癌细胞生长的抑制作用,探讨一种腺病毒介导miRNA治疗肿瘤的新方法。方法:qRT-PCR检测正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Hep3B和Huh7细胞中miR-99a的表达,构建含miR-99a的重组5型腺病毒Ad5-miR-99a。用空载腺病毒Ad-blank和Ad5-miR-99a分别感染Huh7细胞,MTT法和集落形成实验检测miR-99a过表达对Huh7细胞生长的抑制作用。结果:与正常肝细胞L02和其他肝癌细胞相比,miR-99a在肝癌Huh7细胞中表达量相对最低(P<0.01)。成功构建重组腺病毒Ad5-miR-99a,Ad5-miR-99a感染Huh7细胞后,miR-99a可在Huh7细胞中稳定高表达。集落形成实验和MTT实验显示,相对于Ad-blank组,Ad5-miR-99a可显著抑制Huh7细胞的生长和集落形成(P<0.01)。结论:成功构建重组腺病毒Ad5-miR-99a,miR-99a能有效抑制肝癌细胞的增殖,Ad5-miR-99a有可能成为治疗肝癌的新药物。

靶向肝癌表达p16基因的腺病毒载体对裸鼠移植瘤的抗癌活性

目的:利用已构建好的在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体AdAFP-p16,研究腺病毒介导p16基因的表达对肝癌裸鼠移植瘤的抗癌活性。方法:培养肝癌细胞SMMC-7721,于裸鼠右侧腹部近腋下皮肤注射1×106细胞数细胞悬液,建立裸鼠肝癌移植瘤模型。成瘤后给于瘤体内AdAFP-p16病毒注射治疗,病毒总量1×109pfu/只,观察AdAFP-p16对肝癌模型的抗肿瘤疗效以及p16基因表达引起的肝癌细胞病理变化。结果:AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,具有明显的肿瘤生长抑制作用,抑制率可达60.12%(P<0.01),引起肝癌细胞的坏死。结论:AFP启动子控制的p16基因在肝癌细胞中定向表达,能够抑制肝癌模型的生长,对肝癌综合治疗具有重要意义。

TIG3在肝癌中的表达及其抑制作用

[目的]探讨他扎罗汀诱导基因3(TIG3)在肝癌中的表达情况及其抑制作用。[方法]在临床病理组织标本中,通过免疫组化检测肝癌组织和正常肝组织TIG3、核增殖抗原(Ki67)蛋白表达情况。在细胞系中,采用实时定量PCR技术,检测TIG3在正常肝细胞与肝癌细胞中表达情况;利用脂质体2000向TIG3内在表达量最低的细胞中,转染TIG3过表达质粒,通过荧光定量PCR检测转染效果,同时再通过MTT比色法探讨过表达TIG3对肝癌细胞活力的影响。[结果]在临床病理组织标本中,TIG3在肝癌组织中低表达,且与Ki67的表达呈负相关;细胞功能研究发现,过表达TIG3可使肝癌细胞活力下降,肝癌细胞生长增殖受到抑制。[结论]TIG3在肝癌组织中低表达,且可抑制肝癌生长增殖,因此TIG3可能作为肝癌分子靶向治疗新靶点。