白藜芦醇通过调节SIRT1/AMPK信号通路介导自噬反应对膝关节骨性关节炎大鼠细胞凋亡的影响

目的:从沉默信息调节因子1(SIRT1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路介导自噬角度,探讨白藜芦醇对大鼠膝关节骨性关节炎(KOA)软骨细胞凋亡的影响。方法:50只健康Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、白藜芦醇组、白藜芦醇+SIRT1抑制剂组、自噬激活剂组,每组10只。除对照组外其余大鼠均通过注射弗氏完全佐剂造模法复制KOA大鼠模型,白藜芦醇组、白藜芦醇+AMPK抑制剂组、自噬激活剂组分别使用10μmol/kg白藜芦醇、10μmol/kg白藜芦醇+10 mg/kg EX527、2 mg/kg雷帕霉素进行干预,4周后,观察大鼠Lequesne MG膝关节级别;测定大鼠膝关节液中IL-6、肿瘤坏死因子β(TNF-β)水平;HE染色与TUNEL染色观测大鼠膝关节软骨组织形态及凋亡情况;透射电子显微镜观察大鼠软骨细胞自噬情况;Western blot法检测SIRT1、p-AMPK、AMPK、LC3、Beclin-1蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组局部反应、步态反应、关节活动、关节肿胀程度加重(P<0.05);与模型组相比,白藜芦醇组、自噬激活剂组局部反应、步态反应、关节活动、关节肿胀程度减轻(P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠软骨组织细胞排列紊乱,粗糙,存在纤维化变性、边缘丘状隆起,细胞器减少,可见空泡变性,自噬小体数目增多,膝关节液IL-6、TNF-β水平、软骨细胞凋亡率、Beclin-1和LC3B/A升高(P<0.05),软骨组织SIRT1、p-AMPK/AMPK降低(P<0.05);与模型组相比,白藜芦醇组、自噬激活剂组大鼠软骨组织细胞排列紊乱、边缘丘状隆起等现象有改善,自噬小体数目增多,膝关节液IL-6、TNF-β水平、软骨细胞凋亡率降低(P<0.05),软骨组织SIRT1、p-AMPK/AMPK、Beclin-1和LC3B/A水平升高(P<0.05);SIRT1抑制剂可逆转白藜芦醇组对大鼠软骨细胞的保护作用。结论:白藜芦醇可能是通过激活SIRT1/AMPK通路介导自噬KOA大鼠软骨细胞凋亡,SIRT1抑制剂可逆转此过程。

马钱苷调节AKT/AMPK/Nrf2通路改善氧葡萄糖剥夺/复氧诱导的神经元铁死亡的机制研究

目的:探讨马钱苷通过调节蛋白激酶B(AKT)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核因子-E2相关因子2(Nrf2)通路改善氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经元铁死亡的机制。方法:将神经元分为对照组、OGD/R组、OGD/R+L-马钱苷组、OGD/R+M-马钱苷组、OGD/R+H-马钱苷组、OGD/R+H-马钱苷+ML385组。透射电子显微镜观察神经元线粒体形态;检测铁含量、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性、4-羟基壬烯醛(4-HNE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG),还原型辅酶Ⅱ(NADPH)/辅脱氢酶Ⅱ(NADP^(+))及乳酸脱氢酶(LDH)含量;使用CM-H2DCFDA、C11-BODIPY581/591分别检测细胞内和脂质活性氧(ROS)水平;四唑盐(MTT)试剂盒检测细胞活性;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3(cleaved Caspase-3)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)/AKT、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)/AMPK、Nrf2蛋白表达。结果:OGD/R组神经元线粒体出现碎片化现象,嵴减少,线粒体膜密度有所增加。与对照组比较,OGD/R组GSH/GSSG、NADPH/NADP^(+)、SOD、GPX4相对活性、细胞活力以及Bcl-2水平、p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK、Nrf2水平下降(P<0.05),Fe^(2+)含量、细胞内ROS水平、脂质ROS水平以及4-HNE、MDA水平、LDH释放量、Bax以及cleaved Caspase-3水平上升(P<0.05);马钱苷处理后神经元线粒体中的线粒体嵴变得较为完整,碎片化现象消失,OGD/R+L-马钱苷组、OGD/R+M-马钱苷组、OGD/R+H-马钱苷组较OGD/R组GSH/GSSG、NADPH/NADP^(+)、SOD、GPX4相对活性、细胞活力以及Bcl-2水平、p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK、Nrf2水平上升(P<0.05),Fe^(2+)含量、细胞内ROS水平、脂质ROS水平以及4-HNE、MDA水平、LDH释放量、Bax以及cleaved Caspase-3水平下降(P<0.05),且随着马钱苷剂量的增加,改善效果更显著;OGD/R+H-马钱苷+ML385组以上指标与OGD/R组趋势一致。结论:马钱苷可能通过调节AKT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R诱导的神经元铁死亡。

川陈皮素调节AMPK/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞炎性损伤的影响

目的探讨川陈皮素(Nobiletin)调节AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小球系膜细胞HBZY-1炎性损伤的影响。方法将HBZY-1细胞分为5组:正常组、LPS组(100 ng·m L^(-1)LPS)、川陈皮素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素)、AMPK/NLRP3信号通路抑制剂雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)、川陈皮素+雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)。MTT法检测HBZY-1细胞毒性和增殖;ELISA法检测HBZY-1细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot法检测AMPK/NLRP3信号通路蛋白水平。结果与正常组比较,LPS组CAT、SOD、GSH水平、细胞OD值以及AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,川陈皮素组CAT、SOD、GSH水平、OD值以及AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显下降(P<0.05);而雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。与川陈皮素组比较,川陈皮素+雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。结论川陈皮素可能通过上调AMPK/NLRP3信号通路减轻LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤。下调AMPK/NLRP3信号通路可消除川陈皮素对LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤的改善作用。

阿江榄仁酸由AMPK/mTOR/HO-1信号通路调控自噬对糖尿病视网膜病变影响

目的探讨阿江榄仁酸(arjunolic acid,AA)对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜细胞自噬及AMPK/mTOR/HO-1信号通路的影响。方法以健康SD大鼠为研究对象,构建链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型,随机分为对照组(Con)组、模型(STZ)组、AA低剂量(AAL,10 mg/kg)组和AA高剂量(AAH,10 mg/kg)组。连续给药10周后,HE染色检测视网膜组织病理结构;qRT-PCR检测视网膜组织白介素(IL)-1β、IL-6和线粒体丙酮酸转运载体(MPC)-1的mRNA表达;二氢乙锭(DHE)染色评估视网膜组织ROS产生;Western blot检测自噬和AMPK/mTOR/HO-1信号通路相关蛋白表达。结果与Con组比较,STZ组大鼠视网膜出现肿胀和空泡样变化等病理变化,中央视网膜ONL层厚度和细胞核计数明显降低(P<0.01);IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA水平显著增高(P<0.05);视网膜外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)中ROS产生增加(P<0.01);LC3II/I比率、HO-1和p-AMPK/AMPK蛋白表达显著降低,p62和p-mTOR/mTOR表达升高(P<0.01)。与STZ组比较,AAL和AAH组大鼠视网膜ONL厚度和细胞核计数逐渐升高,结构相对规整(P<0.05);AAH组IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达明显降低(P<0.05);视网膜ONL、INL和GCL中ROS产生逐渐降低(P<0.01);LC3II/I比率、p-AMPK/AMPK和HO-1表达逐渐升高,p62和p-mTOR/mTOR表达逐渐降低(P<0.01)。结论阿江榄仁酸可能是治疗DR的候选药物,可能机制为通过AMPK/mTOR/HO-1调节的自噬途径保护视网膜细胞免受STZ诱导的氧化应激和炎症损伤。

AMPK及mTOR与多囊卵巢综合征的关系及中药干预研究进展

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一组生殖内分泌代谢紊乱的综合征,临床以稀发排卵、高雄激素体征、胰岛素抵抗为主要特征,其中育龄期发病率高,对女性生育力造成严重不良影响。PCOS的发生发展涉及多种信号通路,腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)作为细胞能量感受器是其中两个关键靶点。二者在PCOS各个发病部位包括下丘脑-垂体-卵巢轴、子宫内膜、脂肪与骨骼肌中发挥重要的调节作用,通过影响细胞自噬、氧化应激、炎症、线粒体功能、葡萄糖摄取等,促进卵泡的发育和成熟,改善胰岛素抵抗。近年来,中医药因其成分多样、靶点众多等优势广泛应用于临床,研究人员已对PCOS的发病以及中药治疗及改善PCOS的机制进行了大量研究,结果提示AMPK与mTOR相关通路在其中发挥关键作用。通过总结中药干预AMPK与mTOR及其相关通路治疗PCOS的研究结果,为临床治疗及基础研究提供参考。

AMPK介导的饥饿条件下小鼠肝细胞能量代谢转换及脂肪自噬

【目的】通过探究饥饿条件下小鼠肝细胞内能量代谢的过程,揭示其营养感应的变化,筛选调节肝细胞内自噬及能量调控的关键通路,阐明脂质响应能量动员的降解机制。【方法】近交系小鼠(C57/B6)分别完全禁食0、24和48 h,按时间点记录小鼠血糖和体质量的变化,取各组小鼠肝脏组织进行过碘酸雪夫染色和电镜观察;采用RT-qPCR检测糖脂代谢和自噬相关基因mRNA的相对表达量;采用Western-blot检测自噬和能量感应AMPK通路中关键蛋白的表达。【结果】饥饿24和48 h后,小鼠肝组织内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的相对表达量极显著升高,P62蛋白的相对表达量显著降低。饥饿处理引起小鼠肝细胞内主要能量来源发生转换,脂滴招募自噬基因ATG2A和PLIN2的mRNA表达显著上调,线粒体膜蛋白TOM20以及调控能量代谢和脂噬的P-AMPK、P-FOXO1蛋白表达极显著上调,表明饥饿处理导致小鼠肝细胞发生了线粒体自噬和脂噬。【结论】饥饿24 h后,小鼠机体主要能量来源由以糖代谢为主转换为以脂质代谢为主,饥饿处理可能通过激活AMPK和FOXO1促进储存于小鼠肝细胞内的脂质发生脂噬降解,释放游离脂肪酸氧化供能。

补肾健脾中药复方激活AMPK信号通路抑制雌激素缺乏小鼠超重

【目的】观察补肾健脾中药复方(振元颗粒)对雌激素缺乏所致小鼠超重的干预效果及机制。【方法】构建卵巢摘除雌性小鼠模型,观察连续14周灌胃振元颗粒对小鼠体质量和脂肪堆积的影响。构建小鼠3T3-L1前脂肪细胞模型,观察振元颗粒干预对成脂分化的影响。检测小鼠脂肪组织和3T3-L1细胞中调控脂肪细胞形成和脂肪合成的关键基因/蛋白的表达情况,探讨振元颗粒体内外减脂作用的机制。【结果】振元颗粒干预显著降低卵巢摘除小鼠的体质量增量(P<0.01)、性腺周围和腹股沟脂肪指数(P<0.05),显著抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的分化,显著下调脂肪组织和3T3-L1细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、胆固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和脂肪酸合酶(FAS)表达水平(P<0.05),显著提高腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和ACC1的磷酸化水平(P<0.05)。【结论】振元颗粒能抑制脂肪细胞生成,改善雌激素缺乏造成的雌性小鼠超重,其机制与激活AMPK信号通路有关。提示补肾健脾中药复方振元颗粒有助于绝经后女性的体质量控制。

右美托咪定通过激活AMPK减轻TNF-α诱导人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y损伤

目的 研究右美托咪定(DEX)对TNF-α诱导的人成神经细胞瘤细胞系的作用及其机制。方法 采用CCK8检测细胞活性,确定最佳DEX和TNF-α剂量,细胞分为:对照组(control组)、模型组(model组)、DEX干预模型组(DEX组)、DEX联合compound C干预模型组(DEX+CC组);Western blot检测细胞中p-AMPK、SNHP、KIF5B、Drp1、OPA1蛋白表达,ELISA检测IL-1β、IL-6水平,相应试剂盒测定线粒体膜电位(Δψm)、呼吸链复合酶活性(complexⅠ-Ⅳ)、ATP、MDA、SOD、GSH、ROS。结果 模型组较对照组p-AMPK活性、OPA1及SNPH水平显著降低,但Drp1和KIF5B水平显著增高(P<0.01),DEX组较model组complexⅠ~Ⅳ及Δψm、ATP、GSH、SOD水平显著增高,而MDA、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.01);DEX+CC组较DEX组complexⅠ~Ⅳ及Δψm、ATP、GSH、SOD水平显著降低,而MDA、IL-1β、IL-6水平显著增高(P<0.01)。结论 DEX通过依赖AMPK的方式改善线粒体功能、减少氧化应激及炎性反应,减轻TNF-α诱导的细胞损伤。

血清AMPK、HIF-1α在动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者中的表达意义及与病情严重程度、预后的相关性分析

目的分析血清腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、缺氧诱导因子-Iα(HIF-1α)在动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)患者中的表达意义及与病情严重程度、预后的相关性。方法回顾性选择2021年10月至2023年10月泸州市人民医院收治的105例aSAH患者作为观察组,另选同期本院收治的105名体检结果正常者作为对照组。检测所有入选者血清AMPK、HIF-1α表达水平,采用Spearman相关分析法分析aSAH患者血清AMPK、HIF-1α与其世界神经外科医师联盟(WFNS)分级、Hunt-Hess分级、改良Fisher分级的关系。以术后6个月的格拉斯哥预后评分(GOS)≤3分作为判断预后不良的依据,根据预后情况分组:预后良好组75例,预后不良组30例。分析AMPK、HIF-1α在不同预后患者血清中差异性,分析AMPK、HIF-1α与aSAH患者预后不良的关系。使用多因素Logistic回归分析影响aSAH患者预后不良的因素;采用受试者操作特征(ROC)曲线分析AMPK、HIF-1α预测aSAH患者预后不良的效能。结果观察组血清AMPK表达水平为(8.75±1.63)μg/L,低于对照组[(16.82±6.01)μg/L],HIF-1α表达水平为(185.37±46.74)pg/mL,高于对照组[(75.62±15.38)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。经Spearman相关分析,动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者WFNS分级、Hunt-Hess分级、改良Fisher分级与其血清AMPK表达水平呈负相关(P<0.05),与HIF-1α表达水平呈正相关(P<0.05)。预后不良组血清AMPK表达水平为(5.08±1.13)μg/L,低于预后良好组[(13.52±4.82)μg/L],HIF-1α表达水平为(226.57±56.94)pg/mL,高于预后良好组[(136.41±30.58)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。经多因素Logistic回归分析,高血压、动脉瘤直径、HIF-1α均是预后不良的独立危险因素(P<0.05),AMPK是保护性因素(P<0.05)。经ROC曲线分析,血清AMPK联合HIF-1α预测动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者预后不良的敏感度为90.37%,特异度为51.46%,AUC为0.934。结论aSAH患者血清AMPK表达下调和HIF-1α表达上调,两者均与其病情严重程度有关,联合应用可提高对预后不良的预测效能,值得临床予以重视应用。

肉桂醛调节AMPK/SREBP1c信号通路对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝损伤的影响

【目的】探讨肉桂醛通过调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/胆固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)信号通路对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝损伤的影响。【方法】实验随机分为正常组,模型组,肉桂醛低、中、高剂量组及肉桂醛高剂量+Compound C(AMPK抑制剂)组,每组15只小鼠。除正常组,其他各组给予高脂饲料喂养构建NASH模型。干预治疗后,观察肝组织病理形态变化,检测血清生化指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)],肝组织氧化应激指标[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)],AMPK/SREBP1c通路蛋白[磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK、SREBP1c、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、磷酸化ACC(p-ACC)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT1)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd1)]表达,及CPT1α、长链酯酰辅酶A脱氢酶(Lcad)、ACC1、脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA表达水平。【结果】与正常组比较,模型组肝脏脂肪变性,脂质沉积和纤维化间质增多,ALT、AST、TG、TC,MDA含量,SREBP1c、Scd1蛋白表达,ACC1、FAS mRNA表达水平显著升高,SOD、GSH活性,p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、CPT1蛋白表达,CPT1α、Lcad m RNA表达水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,肉桂醛低、中、高剂量组脂质沉积和纤维化间质减少,ALT、AST、TG、TC、MDA含量,SREBP1c、Scd1蛋白表达,ACC1、FAS mRNA表达水平显著降低,SOD、GSH活性,p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、CPT1蛋白表达,CPT1α、Lcad mRNA表达水平显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性;与肉桂醛高剂量组比较,肉桂醛高剂量+Compound C组上述指标均被逆转(P<0.05)。【结论】肉桂醛可能通过调控AMPK/SREBP1c通路,抑制氧化应激,改善肝脏脂肪变性,减轻NASH小鼠肝损伤。

七氟醚通过STING/AMPK信号通路减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤的研究

为探讨七氟醚(sevoflurane)麻醉处理对小鼠肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury, HIRI)的影响及机制,将健康成年C57雄性小鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注+戊巴比妥钠组(HIRI+Pent组)、缺血再灌注+七氟醚组(HIRI+Sevo组),每组10只;经腹腔手术构建小鼠70%肝脏HIRI模型,肝脏缺血60 min,再灌注3 h后,将小鼠处死取材。取肝组织行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,观察肝组织病理损伤,同时采用免疫荧光染色检测髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)含量,并采用TUNEL检测组织细胞凋亡;通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测肝组织炎症相关因子的表达;通过Western-blot检测肝组织干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)等相关蛋白质的表达;采用生化分析仪检测血清丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase, AST)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平;分别采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)比色法、黄嘌呤氧化酶法及二硫代二硝基苯甲酸法测定还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)、脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量。结果显示,与Sham组比较,缺血再灌注后,HIRI+Pent组小鼠血清ALT、AST明显升高,肝脏组织可观察到大片梗死区域,细胞凋亡明显增加, STING、核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)表达升高,同时AMPK下降明显,炎症因子肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-18明显升高, MPO表达明显增加,氧化应激标志物GSH、MDA及SOD水平均出现明显差异,而在HIRI+Sevo组中,上述变化程度均得到明显缓解,且差异具有统计显著性(P<0.05)。结果表明,七氟醚可部分通过STING/AMPK信号通路减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤。

吡格列酮调节AMPK/mTOR信号通路对肺癌A549细胞顺铂耐药的影响

目的探究吡格列酮(PIO)调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对肺癌A549细胞顺铂(CDDP)耐药性的影响。方法将肺癌CDDP耐药细胞A549/CDDP随机分为对照组(Control组)、PIO组(10μmol/L PIO)、CDDP组(10μg/mL CDDP)、CDDP+低浓度PIO组(CDDP+L-PIO组,10μg/mL CDDP+5μmol/L PIO)、CDDP+高浓度PIO组(CDDP+H-PIO组,10μg/mL CDDP+10μmol/L PIO)和CDDP+高浓度PIO组+AMPK激活剂AICAR组(CDDP+H-PIO+AICAR组,10μg/mL CDDP+10μmol/L PIO+20 mmol/L AICAR)。CCK-8法检测细胞增殖能力;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;流式细胞术测定细胞凋亡率;Western Blot检测各组细胞AMPK/mTOR通路蛋白和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达。结果与Control组相比,PIO组A549/CDDP细胞OD 450值(48 h、72 h)、细胞迁移率、细胞侵袭数目、AMPK磷酸化水平、Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞凋亡率、mTOR磷酸化水平、Bax、Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)。与CDDP组相比,CDDP+L-PIO组、CDDP+H-PIO组A549细胞OD 450值(48 h、72 h)、细胞迁移率、细胞侵袭数目、AMPK磷酸化水平、Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞凋亡率、mTOR磷酸化水平、Bax、Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)。AICAR减弱了PIO对肺癌CDDP耐药A549细胞CDDP敏感性的增强作用。结论PIO可能通过抑制AMPK的活化,激活mTOR,增强肺癌A549/CDDP细胞对CDDP的敏感性。

人脐带间充质干细胞通过STAT3和AMPK信号通路调节白介素-6诱导的HeLa细胞的生物活性

宫颈癌是全球第4大常见的女性癌症,目前,手术和放疗仍然是治疗非转移性宫颈癌的主要方法,然而,复发性和转移性宫颈癌尚无有效治疗手段。寻找新的更加有效的宫颈癌治疗靶点就显得尤为重要。已知白介素-6(interleukine-6,IL-6)作为肿瘤促进因子在宫颈癌的发展和转移过程中发挥着十分重要的作用。已有报道显示,间充质干细胞在多种肿瘤中发挥抑癌作用,但对于其内在机制的报道较少;且在宫颈癌的发展过程通常伴随着IL-6表达的增加。在IL-6存在的炎症病理条件下,MSCs对于宫颈癌细胞的增殖和迁移是否仍具有抑制作用仍未可知。本研究通过检测人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)对IL-6诱导的HeLa细胞增殖、迁移、侵袭以及STAT3/Bcl-2、AMPK/mTOR信号通路的调节作用,探讨其对宫颈癌Hela细胞生物活性的影响及其分子机制。集落形成实验、细胞划痕实验以及Transwell侵袭结果证明,炎症因子IL-6显著促进HeLa细胞增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。而20%和50%MSCs条件培养基显著抑制IL-6诱导的HeLa增殖(P<0.0001)、迁移(P<0.01)和侵袭能力(P<0.0001)。进一步的机制研究结果显示,炎症因子IL-6显著上调抗凋亡信号通路中STAT 3和Bcl-2的mRNA(P<0.0001)和蛋白质(P<0.01)含量;同时下调AMPK、TSC 1和TSC 2等基因的表达(P<0.001),最终上调细胞代谢相关基因mTOR的表达(P<0.01)和蛋白质磷酸化水平(P<0.05)。20%MSCs条件培养基显著抑制HeLa细胞中STAT3/Bcl-2信号通路(P<0.05)。50%MSCs条件培养基显著抑制HeLa细胞中STAT3/Bcl-2信号通路(P<0.01)同时激活AMPK/mTOR信号通路(P<0.05),诱导细胞周期阻滞(P<0.0001)。综上所述,MSCs条件培养基通过下调STAT3信号通路和上调AMPK信号通路抑制白介素-6诱导的HeLa细胞的增殖、迁移与侵袭。本研究结果有助于进一步阐释IL-6在宫颈癌中发生发展的作用和机制,为寻找宫颈癌治疗的新研究方向提供实验依据。

苦参碱调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对七氟烷致新生大鼠线粒体自噬的影响

目的探讨苦参碱调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对七氟烷致新生大鼠线粒体自噬的影响。方法将新生大鼠分为对照组、七氟烷组、七氟烷+苦参碱低、高剂量组、七氟烷+苦参碱高剂量+Compound C(AMPK抑制剂)组,每组15只。ELISA法检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-1β水平;HE染色观察海马组织损伤情况,TTC染色法检测大鼠脑梗死面积,TUNEL染色法检测大鼠脑正在细胞凋亡率,透射电子显微镜观察线粒体自噬情况;蛋白质印迹法检测大鼠自噬LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Parkin、PINK1、p62和AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白。结果与对照组相比,七氟烷组大鼠海马神经元显著损伤,血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、脑组织细胞凋亡率、脑梗死面积、p62蛋白表达显著升高,自噬小体和自噬溶酶体数量、脑组织中Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1蛋白表达显著降低(P<0.05);与七氟烷组相比,七氟烷+苦参碱低、高剂量组大鼠海马神经元损伤显著减轻,血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、脑组织细胞凋亡率、脑梗死面积、p62蛋白表达显著降低,自噬小体和自噬溶酶体数量、脑组织中Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1蛋白表达显著升高(P<0.05);抑制剂Compound C可逆转苦参碱对新生大鼠神经元的保护作用。结论苦参碱通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强线粒体自噬水平来减轻七氟烷诱导的新生大鼠神经元凋亡和炎性反应。

蠲痹汤含药血清调控线粒体自噬抑制白细胞介素1β诱导的关节软骨细胞损伤

背景:软骨细胞线粒体自噬的缺陷会引起细胞凋亡和基质消失等软骨细胞退行性病变的变化。目的:探讨蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β诱导的大鼠膝关节软骨细胞炎症反应和凋亡的影响及可能作用机制。方法:50只雄性SD大鼠随机给予生理盐水、蠲痹汤低、中、高剂量(1.24,2.48,4.96 g/kg)、塞来昔布(阳性药物),连续灌胃2周后获得含药血清。①分离软骨细胞,将其随机分为对照组、白细胞介素1β组、蠲痹汤低、中、高剂量含药血清组及阳性药物血清组。CCK-8法检测细胞存活率、免疫荧光双染检测线粒体自噬水平、免疫荧光检测磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶水平、Western blot检测PTEN诱导激酶1/Parkin通路相关蛋白和裂解的半胱氨酸蛋白酶蛋白3表达、ELISA检测炎症因子水平;②分别采用PTEN诱导激酶1 siRNA和Compound C进行干预,探究AMPK/PTEN诱导激酶1/Parkin通路在蠲痹汤含药血清调控线粒体自噬中的作用。结果与结论:①与对照组比较,白细胞介素1β组软骨细胞存活率、Ⅱ型胶原蛋白表达、磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶、PTEN诱导激酶1、Parkin和微管相关蛋白1轻链3蛋白水平以及线粒体自噬水平明显降低(P<0.05),而裂解的半胱氨酸蛋白酶蛋白3蛋白水平、白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α水平显著升高(P<0.05);与白细胞介素1β组比较,蠲痹汤各剂量含药血清组和阳性药物血清组上述各项指标呈现相反的变化(P<0.05);②PTEN诱导激酶1 siRNA可显著抑制蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β处理软骨细胞线粒体自噬的影响,降低蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症与凋亡的保护作用;Compound C逆转了蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β处理软骨细胞中PTEN诱导激酶1/Parkin信号通路的影响。结论:蠲痹汤含药血清通过影响线粒体自噬水平来抑制软骨细胞炎症和凋亡,从而减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞退化,其机制可能与调控AMPK/PTEN诱导激酶1/Parkin通路有关。

AMPK细胞能量感受器研究进展

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作为体内能量感受器能感知能量改变情况.阐述了AMPK在外周组织、肝脏组织、骨骼肌和脂肪组织中的能量代谢调节及在下丘脑中枢中的神经调节等相关作用机制.

AMPK介导上调Bim在大鼠蛛网膜下腔出血后早期皮层神经元凋亡中的作用

目的研究AMP激活的蛋白激酶(AMPK)信号通路在蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠脑组织中的表达,探讨AMPK参与SAH早期脑损伤中细胞凋亡的机制。方法血管内穿刺法建立SAH模型,免疫组化检测AMPK与磷酸化AMPK(p-AMPK)的组织细胞定位,RT-PCR及Western blot检测造模后6、24、48、72h额底皮质AMPK mRNA及p-AMPK、Bim、caspase-3蛋白的动态表达,并与正常对照组和假手术组比较。侧脑室给予AMPK激动剂AICAR及抑制剂Compound C,检测药物干预对大鼠神经行为及凋亡相关蛋白表达的影响,并与SAH组及vehicle组进行比较。结果 SAH后AMPKα的mRNA表达升高,p-AMPK、Bim、caspase-3蛋白表达均持续升高;AICAR可以增高AMPK磷酸化和Bim、caspase-3表达水平,加重神经功能缺损,Compound C可以减低AMPK磷酸化和Bim、caspase-3表达水平,改善神经功能评分。结论 AMPK信号通路参与了SAH后早期脑损伤中神经元细胞凋亡的病理生理过程,其机制可能与调控Bim的转录活性有关,抑制AMPK信号通路可以减轻SAH后皮层神经元凋亡。

厄贝沙坦激活PPAR-γ介导AMPK/mTOR通路诱导自噬改善LO2细胞脂肪变

目的探讨厄贝沙坦调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)介导磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路及自噬对LO2细胞脂肪变的影响。方法采用脂混合物(LM)诱导LO2细胞建立细胞脂肪变模型,将造模后细胞分为模型组、厄贝沙坦组和厄贝沙坦联合PPAR-γ抑制剂组,另设正常组。分别干预24 h后,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)含量,并行油红O染色分析细胞内脂质沉积,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞PPAR-γ、AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达,应用激光共聚焦技术观察自噬标志蛋白LC3B的变化。结果10μmol/L及以下浓度的厄贝沙坦对LO2细胞生长无明显毒性作用,20μmol/L厄贝沙坦对细胞毒性作用较大,表现出明显的抑制作用。与正常组比较,模型组LO2细胞内TG和TC含量升高,油红O染色显示脂质大量沉积,PPAR-γ、p-AMPK和LC3B蛋白表达水平降低,mTOR磷酸化水平升高(均P<0.05);与模型组比较,经厄贝沙坦治疗后,LO2细胞内TG和TC含量降低,油红O染色显示脂质沉积减少,PPAR-γ、p-AMPK和LC3B蛋白表达水平升高,mTOR磷酸化水平降低(均P<0.05);但经厄贝沙坦联合PPAR-γ抑制剂干预后,PPAP-γ抑制剂抑制了厄贝沙坦对LO2细胞脂肪变的治疗作用。结论厄贝沙坦可通过激活PPAR-γ介导的AMPK/mTOR信号通路,促进LM诱导LO2细胞的自噬,从而减轻脂质沉积,改善肝细胞脂肪变。

祛湿化瘀方通过调节AMPK活性改善高脂饮食诱导的实验性脂肪肝肝脏脂肪代谢

目的:研究祛湿化瘀方对高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝AMPK蛋白活性及其相关脂肪代谢靶蛋白活性的影响,以探讨该方防治实验性脂肪肝的作用机制。方法:采用高脂饲料饮食诱导大鼠脂肪肝模型,造模大鼠给予高脂饮食4周后,按随机数字表随机分为模型组及祛湿化瘀方组,分别灌胃给予饮用水及中药祛湿化瘀方4周。实验8周末取材后观察:1)肝组织三酰甘油(Triglyceride,TG)、游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)含量,2)肝组织病理变化(HE染色、油红染色),3)肝组织腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-Activated K inase,AMPK)及磷酸化AMPK、肝组织总蛋白及核蛋白固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c、SREBP-1c)、肝组织总蛋白及核蛋白碳水化合物反应元件结合蛋白(Carbohydrate Response Element Binding Protein、ChREBP)含量、肝组织乙酰辅酶A羧化酶(Acety1 Co A Carboxylase,ACCase)及磷酸化ACC蛋白含量,4)肝组织AMPKα1、AMPKα2、SREBP-1、ACCα、SREBP-1c及ChREBP基因表达水平。结果:1)模型组肝组织TG、FFA含量显著升高,肝组织出现明显大泡样脂肪变性;模型组肝组织AMPK蛋白磷酸化水平降低、核蛋白SREBP-1与ChREBP表达增加、ACC蛋白磷酸化水平降低蛋白活性升高。2)祛湿化瘀方组肝组织TG、FFA含量较模型组显著降低,肝组织炎症及脂肪变性程度减轻;祛湿化瘀方能显著升高肝组织AMPK、ACC蛋白磷酸化水平、降低核蛋白SREBP-1及ChREBP含量。结论:祛湿化瘀方通过调节AMPK活性及其相关靶蛋白活性改善高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝肝脂肪代谢,这可能是该方有效防治实验性脂肪肝的重要作用机制之一。

AICAR和二甲双胍对产蛋鸡肝细胞AMPK活性及脂质代谢的影响

以产蛋鸡肝细胞为材料,研究添加腺苷一磷酸激活的蛋白激酶(AMPK)激活剂AICAR和治疗二型糖尿病药物———二甲双胍对产蛋鸡肝细胞AMPK、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和细胞脂质代谢的影响。试验分4个处理:基础培养液组(对照组)、基础培养液组中分别加入0.5mmol/L AICAR、0.5 mmol/L二甲双胍1、mmol/L二甲双胍。结果表明,肝细胞培养100 min时,AICAR和二甲双胍均可激活AMPK(P<0.05),且二甲双胍激活AMPK具有一定的浓度依赖性;AICAR和二甲双胍均可不同程度抑制脂肪酸和胆固醇合成的关键酶ACC和HMGR的活性,AMPK活性与HMGR、ACC活性呈一定的负相关;添加AICAR和二甲双胍抑制产蛋鸡肝细胞甘油三酯和胆固醇合成,AMPK活性与肝细胞甘油三酯和总胆固醇含量也呈一定的负相关。因此,可通过调控产蛋鸡肝脏AMPK活性变化从而调节产蛋鸡脂肪和胆固醇的合成。