白眉蝮蛇去整合素Adinbitor对Akt信号转导通路及对SSMC7721细胞增殖、迁移和凋亡的影响

研究白眉蝮蛇去整合素adinbitor对蛋白激酶B(Akt)通路信号分子的影响及对SSMC7721细胞增殖、迁移及凋亡的影响.采用MTT法检测adinbitor对SSMC7721细胞增殖的作用;Hoechst33258试剂盒检测adinbitor对SSMC7721凋亡的影响;Transwell检测adinbitor对SSMC7721细胞迁移的作用;Western印迹检测adinbitor对信号分子Akt及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、核因子κB(NF-κB)的抑制蛋白IκB-α及NF-κBp65的影响;分光光度法检测其对半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)活性的影响.结果显示,adinbitor可显著抑制SSMC7721细胞的迁移和增殖(与对照组比较,P<0.05),促进凋亡.在浓度梯度adinbitor作用下,Akt表达量基本不变,但其磷酸化受到抑制.细胞浆内IκB-α表达增加,细胞核内NF-κBp65表达减少,caspase-3活化倍数平均在2.24～3.85之间,以上作用均呈现剂量依赖性.结果说明,adinbitor可通过抑制Akt相关信号转导分子的作用而抑制SSMC7721细胞增殖和迁移,并促进其凋亡.

Adinbitor对人胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的作用

目的探讨Adinbitor对人胃癌MGC803细胞生长及凋亡的作用。方法应用Adinbitor作用于体外培养的人胃癌MGC803细胞,采用MTT比色法分析其对MGC803细胞生长的影响;采用相差显微镜、苏木精-伊红(HE)和Hoechst染色观察不同浓度的Adinbitor诱导MGC803细胞凋亡的形态变化。结果Adinbitor可呈剂量依赖性方式抑制MGC803细胞的增殖,其抑制MGC803细胞增殖的ID50为3.52μmol/L。Adinbito诱导的MGC803细胞凋亡实验,显示出细胞凋亡的典型的形态学特征,如胞间连丝消失,细胞皱缩成团,胞内出现空泡等现象,而且随Adinbitor浓度的增加,凋亡现象越明显。结论Adinbitor对人胃癌MGC803细胞生长具有抑制作用,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。

Adinbitor对B16黑色素瘤细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响

目的探讨Adinbitor对B16黑色素瘤细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法 MTT法检测Adinbitor对B16黑色素瘤细胞增殖的影响;双苯并咪唑(Hoechst33258,Ho)染色法观察Adinbitor作用于B16黑色素瘤细胞后细胞形态的改变;结晶紫染色法和聚碳酸酯膜浸润试验观察其对黑色素瘤细胞体外黏附以及迁移的影响。结果 Adinbitor可呈剂量依赖性方式抑制B16黑色素瘤细胞的增殖,其抑制B16黑色素瘤细胞增殖的ID50为2.68μmol/L。Adinbitor可明显诱导黑色素瘤细胞凋亡,并且剂量依赖性地抑制瘤细胞的黏附和迁移(P<0.01)。结论 Adinbitor在体外能够显著降低黑色素瘤细胞的黏附及迁移能力,有效地抑制黑色素瘤细胞的增殖,同时促进细胞凋亡。

白眉蝮蛇去整合素rAdinbitor对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞黏附与增殖的影响

背景与目的:蛇毒去整合素是一类从多种蛇毒和水蛭中分离到的含RGD(Arg-Gly-Asp)或KGD(Lys-Gly-Asp)模体的小分子蛋白质,其由于能竞争性地结合细胞表面的整合蛋白受体,阻断肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,从而发挥抗肿瘤转移的作用。rAdinbitor是我实验室采用基因克隆方法从大连产白眉蝮蛇(Gloydiusblomhoffibrevicaudus)的毒腺中获得的一种含有RGD模体的去整合素。本实验的目的是探讨rAdinbitor对人肝癌细胞系SMMC-7721黏附、增殖的抑制作用,为rAdinbitor抗肿瘤转移的作用机制提供实验依据。方法:以细胞黏附实验观察纤连蛋白(FN)基质对SMMC-7721细胞黏附的影响。分别采用结晶紫染色法和MTT比色法测定重组蛋白rAd-inbitor对SMMC-7721向FN黏附的影响,及对已黏附于FN上的SMMC-7721的影响。以MTT比色法检测不同浓度的rAdinbitor对SMMC-7721细胞增殖的影响;HE染色观察200μg/mlAdinbitor诱导SMMC-7721细胞36h凋亡的形态变化;采用流式细胞仪检测rAdinbitor对细胞凋亡的诱导作用。结果:①rAdinbitor对SMMC-7721细胞在FN基质上的黏附有一定的抑制作用,并呈浓度依赖关系,25、50、100、200μg/ml浓度组rAdinbitor的黏附抑制率分别为4.90%、11.73%、22.84%、37.28%,各组差异有显著性(P<0.05)。②rAdinbitor作用后,已黏附的SMMC-7721细胞变圆、脱落,各浓度组黏附细胞的存活率的平均值分别为98.89%、90.01%、63.37%、35.13%,细胞的增殖受到明显抑制(P<0.05)。③rAdinbitor对SMMC-7721细胞的增殖具有较强的抑制作用,且随着药物浓度的增加,其抑制作用增强(P<0.05)。rAdinbitor对SMMC-7721细胞作用48h的IC50值为177.83μg/ml。④200μg/mlrAd-inbitor作用SMMC-7721细胞36h呈现早期细胞凋亡的形态改变,凋亡率达20.68%,明显高于未经处理的对照组的2.38%(P<0.05)。结论:重组白眉蝮蛇去整合素rAdinbitor能够剂量依赖性地抑制SMMC-7721细胞在FN上的黏附,并促使已黏附的SMMC-7721细胞脱落,剂量依赖性抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡。

基因重组白眉蝮蛇去整合素Adinbitor对人肝癌细胞系SSMC7721增殖、凋亡和侵袭的影响

[目的]研究基因重组白眉蝮蛇去整合素Adinbitor对SSMC7721细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。[方法]用Hoechst33258试剂盒染色,观察Adinbitor对细胞形态的影响;Western-blotting检测浓度梯度Adinbitor作用下Caspase-3表达情况,分光光度法考察Caspase-3活化程度;MTT法检测Adinbitor对细胞增殖的作用,Transwell及Matrigel检测其对细胞侵袭的影响。[结果]Hoechst染色显示Adinbitor可明显促进细胞凋亡。在Adinbitor作用下,胞浆Caspase-3含量减少,活化程度增高,活化倍数2.24－3.85。Adinbitor可明显抑制SSMC7721细胞增殖,IC50为0.296μmol,也可抑制细胞侵袭能力。[结论]基因重组Adinbitor可明显抑制SSMC7721细胞的增殖及侵袭,并且可通过活化Caspase-3促进细胞凋亡。

白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体的构建及其功能检测

目的构建白眉蝮蛇去整合素Adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制。方法重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列,表达并纯化突变体蛋白。血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体内血管新生试验检测其对血管新生的抑制功能;流式细胞仪检测其对血小板膜受体去整合素αⅡbβ3与CD41结合的影响。结果双酶切、PCR及测序证实突变体构建正确,纯化的突变体蛋白纯度在90%以上。野生型Adinbitor可识别αⅡbβ3,竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,从而发挥抑制血小板聚集的功能;在相同剂量下,突变型Adinbitor几乎不具备此功能,而保留了抑制血管新生的功能。结论已成功构建了白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体,与野生型Adinbitor比较,突变体抑制血小板聚集的功能得到了有效抑制,抑制血管新生功能保持不变,为其今后的功能开发奠定了理论基础。