BrdU标记家兔脂肪组织来源干细胞的体外研究

目的通过采用BrdU标记连续培养的家兔脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stromal stem cells,ADSCs),检测其最佳标记时间、标记剂量及毒性作用,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性。方法8～12周龄健康新西兰大白兔6只,雌雄不限,体重1.5～2.0kg。切取腹股沟皮下1～2mL脂肪组织,采用贴壁法体外分离培养ADSCs,并进行鉴定。取第3代细胞以终浓度分别为5、10、15和20μg/mL的BrdU进行标记,分别记为A、B、C及D组;另1孔不含BrdU,作为空白对照(E组)。标记12、24、48和72h后,采用免疫组织化学检测各组细胞阳性率,苔盼蓝排染法行细胞计数观察标记后细胞活性。结果原代培养的ADSCs形态主要为宽大、扁平、短梭形细胞;传代后细胞形态主要为长梭形;第3代ADSCs经诱导均能向成骨细胞和脂肪细胞分化。免疫组织化学观察:第3代ADSCs经BrdU标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光。孵育12h,A、B、C、D组细胞标记阳性率逐渐增高,分别为30.6%±2.3%、32.4%±1.9%、45.8%±1.8%、50.8%±3.1%,C、D组与A组比较,差异有统计学意义(P<0.01);24h,A、B、C及D组标记率分别为45.9%±2.0%、87.9%±3.3%、90.6%±2.9%及91.7%±3.2%;48h和72h,A、B、C、D组标记情况与24h相似;E组各时间点细胞标记阳性率为0。孵育24、48及72h,B、C及D组细胞阳性率与A组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。孵育12、24、48及72h细胞计数,各组细胞活性均在90%以上,A、B、C、D组与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论BrdU标记ADSCs的最佳时间为48h,最佳浓度为10μg/mL;BrdU对细胞标记率及安全性高。

BrdU标记胎兔骨髓间充质干细胞及对细胞生物学行为影响的体外研究

目的:通过用5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记胎兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs),探讨BrdU作为干细胞标记示踪方法的可行性。方法:取胎兔骨髓组织密度梯度离心法分离培养BMSCs。取P3代细胞以终浓度分别为5,10,15,20mg/L的BrdU进行标记,分别记为A,B,C,D组;另1孔不含BrdU,作为空白对照(E组)。标记12,24,48,72h后,采用免疫组织化学检测各组细胞阳性率,苔盼蓝排染法细胞计数观察标记后细胞活性。结果:细胞培养观察:原代培养的细胞形态主要为宽大扁平短梭形细胞;传代后细胞形态为长梭形;第3代BMSCs经诱导均能向成骨细胞和脂肪细胞分化。免疫组织化学观察:第3代BMSCs经BrdU标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光。孵育12h,A,B,C,D组细胞标记阳性率逐渐增高,分别为(33.2±4.3)%、(34.5±3.9)%、(47.9±4.8)%、(52.8±5.1)%,对照组细胞标记阳性率为0,C,D组与A组比较,差异有统计学意义(P<0.01);24h,A,B,C,D组标记率分别为(48.1±4.0)%、(83.4±5.3)%、(91.7±4.9)%、(92.6±4.2)%,对照组细胞标记阳性率为0。48h和72h,A,B,C,D,E组标记情况与24h相似。孵育24,48,72h,10,15,20mg/L组细胞阳性率与5mg/L组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞计数:孵育12h,各组细胞活性均在90%以上,A、B、C、D组与对照组(E)比较,差异无统计学意义(P>0.05);孵育24,48,72h,各组细胞活性情况与12h情况相似,A,B,C,D组与对照组(E)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。随着标记时间的延长和BrdU剂量的增加,标记率逐渐增高,BrdU终浓度为10mg/L以上,且标记48h后细胞标记率>90%,活细胞数>90%。结论:BrdU标记BMSCs的最佳时间为48h,最佳浓度为10mg/L;BrdU对细胞毒性小,标记率及安全性高。