小豆Dirigent基因家族鉴定及锈菌侵染对不同成员表达的影响

为明确Dirigent (DIR)基因在小豆抗锈病中的作用,采用生物信息学方法,对小豆DIR基因家族(VaDIRs)进行了全基因组鉴定,结果发现小豆中共有33个DIR基因,其中29个成员分别定位在8条染色体上,系统进化分析表明,VaDIRs包括DIR-a、DIR-b/d、DIR-e和DIR-f四个亚家族,对VaDIRs成员启动子区顺式作用元件的分析发现,VaDIRs启动子区均包含激素、病原体应答等元件。对小豆抗锈病品种接种后不同时间的转录组数据分析发现,差异表达基因中共有17个VaDIRs成员,其中6个于接种后24 h显著上调,2个于接种后24 h和48 h均高量表达。进一步应用qRT-PCR技术对上述8个基因在抗、感品种中应答锈菌侵染的表达分析表明,高抗品种中VaDIR14、VaDIR16和VaDIR33的表达量在锈菌侵染不同阶段均显著高于感病品种。上述结果表明,VaDIRs家族成员可作为正调节因子参与小豆对锈病的抗性。

小豆锈病、白粉病及褐斑病的抗性基因遗传分析

研究结果表明：（１）Ｓ５０３３种质具有抗锈病和抗白粉病基因，而京农２号具有对应的感病基因；（２）抗锈病和抗白粉病性均为显性，受一对基因控制；（３）经Ｘ２测验控制小豆褐斑病的基因有３对，它是一个数量性状，且具微效及累加作用；（４）对本研究所涉及的基因命名如下:１．抗锈性：ＸＸ，感锈性ｘｘ；２．抗白粉病性：ＢＢ，感白粉病性：ｂｂ；３．高抗褐斑病性Ｈ１Ｈ１Ｈ２Ｈ２Ｈ３ｈＨ３，高感褐斑病性ｈ１ｈ１ｈ２ｈ２ｈ３ｈ３。）、与中亲值（ＭＰ）也呈极显著正相关（ｒａｂ＝０．８７７），说明Ｆ１抗性强弱决定于亲本抗性。用高抗材料作为亲本之一的Ｆ１均表现为高抗，表明控制小豆的抗锈病的基因为显性遗传。抗为显性、感为隐性，用符号Ｘ、ｘ表示。２．１．３不同抗性基因杂交组合Ｆ２的表现作者对５个杂交组合的Ｆ２代单株抗、感分离比率进行了调查和统计分析（表４），结果表明：ＨＲ×ＨＳ、ＨＲ×Ｓ、Ｓ×ＨＲ接种后Ｆ２代各组合的Ｒ：Ｓ均符合３：１。由此表明，小豆对锈病的抵抗性受单个基因控制，从中抗、中感组合及抵抗性程度来看，还存在影响显性基因表达的增强子和减弱子修饰基因的作用，否则以上结果难以解释。若设对抗性程度起修饰作用的增强子为隐性，减弱子为显性。

红小豆锈病菌夏孢子萌发条件研究

豇豆单胞锈菌是引起红小豆锈病的病原菌。为了明确红小豆锈病菌夏孢子的萌发条件,以红小豆锈病菌ZXL01菌株为材料,研究了培养方法、温度、光照、储存条件和储存时间对红小豆锈病菌夏孢子萌发的影响。结果表明,最适红小豆锈病菌夏孢子萌发的培养方法为水琼脂平板法,夏孢子在水琼脂上2 h即开始萌发,随着培养时间的延长,萌发率逐渐升高,6 h后萌发率趋于稳定,萌发率为75.0%。夏孢子在15~25℃均可萌发,最适萌发温度为20℃。光照可明显抑制夏孢子萌发。夏孢子在4℃条件下储存360 d后已基本丧失萌发能力,而夏孢子在-20℃条件下储存360 d时仍可保持萌发活力。

褪黑素诱导小豆抗锈病机理的初步研究

为明确外源褪黑素诱导小豆抗锈性的作用及机理,以感病小豆品种‘宝清红’为材料,采用叶面喷施不同浓度褪黑素激发处理小豆真叶,而后对真叶挑战接种锈菌夏孢子,结果表明,低浓度(11.61 mg/L)褪黑素可显著提升小豆对锈病的抗性。夏孢子萌发试验表明,褪黑素对夏孢子萌发及芽管生长无显著抑制作用,表明褪黑素无抑菌活性。进一步的基因表达分析发现,与对照相比,褪黑素激发诱导了水杨酸(SA)通路关键基因NPR1于接种后24 h显著上调表达,且病程相关蛋白PR1、几丁质酶(CHI)、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)及PR5均于接种后24~120 h被显著诱导表达,说明褪黑素可能通过诱导NPR1表达,进而激活下游PR蛋白的高水平应答,使感锈病小豆品种获得对锈病的抗性。

小豆VaDREB1A基因克隆及其应答锈菌侵染的表达分析

为明确小豆VaDREB1A在抗锈菌侵染过程中的作用,本研究分别从小豆基因组DNA及cDNA中克隆了该基因,测序结果表明VaDREB1A无内含子,全长660 bp编码219个氨基酸,氨基酸序列包含1个AP2结构域,序列特征及系统发育分析表明VaDREB1A属于DREB/CBF亚家族A1亚类。启动子顺式元件分析发现,VaDREB1A启动子包含乙烯、水杨酸及生物和非生物胁迫等响应元件。对该基因响应豇豆单胞锈菌(Uromyces vignae)侵染的表达分析发现,与不接种对照相比,VaDREB1A在抗病品种中于接种后24 h和120 h显著下调,而在感病品种中于接种后120 h和192 h显著上调。在1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)诱导小豆抗锈病过程中,VaDREB1A的表达与其在抗病品种中的表达相似,分别于ACC处理并接种后24 h和192 h显著下调。上述结果说明VaDREB1A可能参与小豆对锈病的抗性。

黑龙江省一株红小豆锈病病原菌鉴定

【目的】为明确发生在黑龙江省大庆市红小豆田中的锈病病原物的分类地位。【方法】从大庆市采集红小豆锈病标样,采用单孢子堆分离法获得一株红小豆锈病菌纯培养物ZXL01。采用观测夏孢子芽孔数目、位置和冬孢子壁厚度等形态学特征结合ITS序列分析的方法,对其进行鉴定。【结果】ZXL01夏孢子发芽孔多为2个,位于孢子赤道部位较远之处,冬孢子壁厚度为2.9μm-3.3μm。在基于r DNA-ITS序列构建的系统发育树中,ZXL01菌株与两株豇豆单胞锈菌(Uromyces vignae)的参比菌株(Gen Bank登录号:AB115718和AB115731)在自举值99%相聚一群。用豇豆单胞锈菌的特异性引物UV-ITSF/R进行检测,ZXL01菌株可扩增出500 bp左右的特征片段。【结论】黑龙江省大庆市红小豆锈病病原菌ZXL01菌株为豇豆单胞锈菌,ZXL01菌株的Gen Bank登录号是KM461700。

小豆抗锈病诱导剂的筛选

由豇豆单胞锈(Uromyces vignae)引起的小豆锈病是我国小豆生产中的重要病害之一[1,2],在中国华北及东北地区发生严重,可造成严重的产量损失[3]。当前小豆锈病的防治主要依赖化学药剂,但长期使用化学药剂存在残留、破坏生态等弊端。因此寻找绿色可持续的防控措施越来越受到人们的关注。利用外源诱导剂诱导植物抗性是一种潜在的病害防控措施[4]。

小豆AP2/ERF基因家族鉴定及其应答锈菌侵染的表达分析

为明确小豆VaAP2/ERF家族基因在小豆应答豇豆单胞锈菌(Uromyces vignae)侵染中的作用,本研究采用生物信息学方法从小豆基因组中鉴定VaAP2/ERFs家族基因186个,包括AP2(24个)、RAV(2个)、Soloist(1个)及ERF(159个)四个亚家族,其中ERF亚家族又可分为DREB和ERF两个亚类。基因结构分析发现,68.3%的VaAP2/ERFs基因不具内含子。保守基序分析发现,各亚族成员保守域组成类似,可作为基因家族分类的重要依据。前期转录组测序发现VaAP2/ERF中的6个成员接种后24 h显著上调,进一步应用qPCR技术对其在‘1-D-3’(免疫)及‘宝清红’(感病)中应答锈菌侵染的表达分析发现,免疫品种中6个成员均于接种后6 h及120 h显著上调,另有2个于接种后12 h也显著上调,表明上述基因均在小豆抗锈病中发挥正调控作用。

小豆种质资源对锈病的抗性评价

为筛选小豆(Vigna angularis)抗锈病性资源,本研究以54份小豆种质资源为材料,通过室内接种豇豆单胞锈菌(Uromyce vignae)菌株ZXL01,并分析叶片表面花斑轻重和每1.5 cm2夏孢子堆的数量,以评价小豆种质资源对锈病的抗性。结果表明,供试材料对小豆锈病的抗性存在明显差异。15份种质资源表现抗病,其中,吉林373和QH2对锈病表现免疫,占供试品种的3.7%;龙垦早红、北4、LZX031、建37、建265和QH1高抗锈病,占供试品种的11.1%;保M908-15、极旱红小豆、吉红6号、北12、湾选1号、保8824-17和北10为中抗种质资源,占供试品种的12.9%。其余39份种质资源均对小豆锈病表现感病。本研究筛选获得小豆抗锈病资源可为田间生产和抗病品种培育提供重要参考。

小豆VaWRKY33基因克隆及其响应锈菌侵染的表达分析

为明确小豆VaWRKY33基因对抗锈病的作用,本研究以小豆基因组DNA为模板克隆了该基因全长。VaWRKY33的基因序列全长2 442 bp,包含4个内含子,编码区全长1 620 bp,编码539个氨基酸。VaWRKY33蛋白质相对分子质量为60.16 kD,理论等电点为7.66,属于亲水性不稳定蛋白,有一个跨膜结构域,包含蛋白磷酸化位点85个。蛋白序列分析表明,VaWRKY33包含两个保守的WRKY结构域,锌指结构类型为C2H2型,属WRKY转录因子家族GroupⅠ亚家族。VaWRKY33启动子区分析发现,除核心作用元件外,主要包括光响应、逆境及组织特异性等三类顺式作用元件。基因表达分析表明,VaWRKY33在抗病品种‘庆红1号’(QH1)上于接种病菌12 h时开始显著上调,并在整个侵染过程中始终显著高于不接种对照;在感病品种‘宝清红’(BQH)上于接种病菌48~192 h时,VaWRKY33基因显著上调表达,但其响应时间较抗病品种明显滞后,推测VaWRKY33在病菌侵染早期的迅速响应在小豆抗锈菌侵入阶段发挥正调控作用。