蜻蜓凤梨AfFT3基因克隆及功能鉴定

【目的】克隆蜻蜓凤梨成花素基因AfFT3,并鉴定其生物学功能,为深入解析凤梨科植物开花分子机制提供理论依据。【方法】克隆AfFT3基因,利用生物信息学软件进行序列分析,并通过实时荧光定量PCR探究其在低温(18℃)、常温(25℃)和高温(35℃)及外源乙烯处理下的表达情况,采用农杆菌浸花法将AfFT3基因转入拟南芥,观察转基因植株表型,通过异源表达预测其生物学功能。通过酵母单杂交试验初步鉴定其启动子与AfEIN3蛋白的互作关系。【结果】从蜻蜓凤梨中克隆获得AfFT3基因全长570 bp,编码区(CDS)序列为465 bp,编码154个氨基酸残基,蛋白分子量为17.3 kD,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜螺旋区,含有PKC、PKA、cdc2、INSR和GSK3等多个蛋白激酶磷酸化位点。同源序列比对发现,AfFT3蛋白中有2个氨基酸残基^(138)Trp和^(140)Gln突变为^(138)Met和^(140)Glu。系统发育分析结果显示,该蛋白属于PEBP家族的FT-like蛋白亚家族,与TFL-like亚家族的亲缘关系较近。与对照(大棚正常条件下栽培植株)相比,高温和低温处理下AfFT3基因在蜻蜓凤梨中的相对表达量显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)升高。在高温、常温和低温条件下,使用外源乙烯处理后,AfFT3基因在蜻蜓凤梨中的相对表达量均较对照显著或极显著升高,在常温处理下其相对表达量最高。共获得6个转基因拟南芥株系(L_(1)~L_(6)),其中转基因株系L_(3)和L_(6)较转空载体拟南芥和野生型拟南芥延迟抽薹8 d。通过分段扩增获得AfFT3基因启动子3段序列(AfFT3-P1、AfFT3-P2和AfFT3-P3),长度分别为390、1077和552 bp,通过酵母单杂试验推测启动子序列AfFT3-P1和AfFT3-P3可与AfEIN3蛋白发生互作。【结论】高温、低温胁迫和乙烯均不同程度诱导AfFT3基因的高效表达,但在高温和低温条件下乙烯对AfFT3基因的表达诱导效果较常温有所降低,其转基因株系延迟抽薹,说明AfFT3基因参与调控蜻蜓凤梨开花过程,且响应温度和乙烯信号。

蜻蜓凤梨的组织培养和快速繁殖

用蜻蜓凤梨短缩茎作外植体培养 ,成功地建立了蜻蜓凤梨快速繁殖程序。蜻蜓凤梨短缩茎纵切块接种在MS培养基上诱导侧芽萌发 ;侧芽在MS +6 BA 4mg/L +NAA 1mg/L+IAA 1mg/L的培养基上继代增殖效果较好 ;不定芽在MS +IBA 0 .1mg/L培养基上易生根。

粉菠萝FVE同源基因的克隆及表达分析

FVE是植物自主开花途径中的关键基因,主要通过抑制FLC的表达来调控花发育过程。本研究利用粉菠萝(Aechmea fasciata)茎尖组织转录组序列数据,通过RACE技术克隆获得了粉菠萝中FVE同源基因AfFVE的cDNA全长序列。该序列全长为1 672 bp,开放阅读框为1 404 bp,编码由468个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白序列中含有6个保守的WD重复区域。氨基酸序列比对结果表明,AfFVE基因编码的氨基酸序列与其它物种中FVE的同源序列具有较高的相似性。qRT-PCR(实时荧光定量PCR)分析结果显示,粉菠萝中AfFVE基因对外源乙烯的刺激产生了应答。在采用乙烯利灌心处理不同时间的过程中,发现AfFVE基因的转录水平均在处理后1 d时达到最大,推测AfFVE可能参与乙烯信号反应,该基因在粉菠萝自主开花途径中的调节作用可能受乙烯影响。

粉菠萝组培快繁的研究

报道了观赏凤梨的主要种类之一———粉菠萝[Aechmea fasciata(Lindl.)Baker]的组培快繁技术体系的研究结果:用茎段作为外植体,以MS+100 mg.L-1肌醇+0.5 mg.L-1烟酸+1.0 mg.L-1盐酸硫胺素+0.5 mg.L-1盐酸吡哆素+2.0 mg.L-1甘氨酸+2.5 mg.L-1BA+0.25mg.L-1NAA+7 g.L-1的琼脂+25 g.L-1的蔗糖作为初代培养基(pH=5.8),成功地建立了无菌材料;增殖培养基的成份与初代培养基完全相同时,经连续6个月的培养(此期间不更换新鲜培养基),繁殖系数可达8.9倍;试验了不同种类和不同浓度配比的生长调节剂对粉菠萝增殖培养效果的影响,在其它条件完全相同的情况下,以NAA=0.5 mg.L-1的处理(不附加细胞分裂素类生长调节剂)能取得最理想的增殖效果,繁殖系数为9.51,而且植株嫩绿、粗壮、长势最好;生根壮苗培养基中的生长调节剂(IBA)浓度为1.0 mg.L-1,其余成分与初代培养基完全相同,在该培养基上培养180 d的粉菠萝组培苗,平均株高可达10.74 cm,单株平均根数可达10.32条,单株平均根长为2.51 cm;粉菠萝组培苗容易移栽成活,移栽成活率可达95%以上.

受乙烯诱导表达的蜻蜓凤梨MAPKK基因的克隆与序列分析

利用抑制性差减杂交文库筛选到的1个被乙烯诱导并与已知植物促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK;MKK)同源的cDNA片段,通过RACE技术得到该基因的全长cDNA序列。生物信息学分析表明,该基因属于植物MAPKK的A亚族,具有植物MAPKK的磷酸化一致序列S/T*****S/T。利用半定量RT-PCR检测该基因的表达量在乙烯处理后增强,推测其在乙烯诱导途径中起重要作用。

蜻蜓凤梨AfACO1基因的克隆及乙烯响应特性分析

观赏凤梨是一种重要的热带花卉。生产上常人工施加外源乙烯或乙烯衍生物促进凤梨科植物开花,但作用的分子机制不清楚。以热带观赏花卉蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)为材料,利用转录组数据结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了乙烯生物合成过程中限速酶1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1carboxylate,ACC)氧化酶(ACC oxidase,ACO)的一个编码基因,将其命名为AfACO1。AfACO1cDNA全长732bp,编码156个氨基酸。理化性质分析表明,该蛋白分子质量为17.47ku,等电点为8.46。AfACO1蛋白有保守的抗坏血酸和辅因子亚铁离子结合位点。进化树分析结果表明,AfACO1与水稻的2个OsACO1-likes蛋白亲缘关系最近,且进一步的结构域分析表明,它们拥有相似的保守基序。实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)结果表明,AfACO1在抽薹39d后的成株心叶中表达量最高,且施加外源乙烯利后,AfACO1的表达量逐渐上调。结果表明AfACO1可能是蜻蜓凤梨成熟期乙烯生物合成的关键酶之一。研究结果为解析外源乙烯调控凤梨科植物开花的机制奠定了基础。

蜻蜓凤梨花发育相关B类MADS-box基因克隆及表达分析

为探索MADS-box基因在凤梨花发育过程中的调控机制,通过设计简并引物,利用RACE技术,从蜻蜓凤梨花蕾中分离得到2个花发育相关B类MADS-box基因,分别命名为AfAP3和AfPI;AfAP3cDNA全长957bp,编码区编码226个氨基酸;AfPI cDNA全长808bp,编码区编码198个氨基酸,二者均具有典型的植物MADS-box蛋白结构.RT-PCR分析结果表明,AfAP3和AfPI基因主要在花器官中表达,在根系中也有微量表达;乙烯诱导后7d,AfPI基因在茎尖处开始有表达,表明此时蜻蜓凤梨花芽分化可能已经完成,AfAP3基因表达晚于AfPI.

蜻蜓凤梨快速繁殖的研究

通过对蜻蜓凤梨快速繁殖进行研究,结果表明:用蜻蜓凤梨试管苗茎的中部进行诱导侧芽效果比较好,培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L;增殖阶段适宜培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L或MS+6-BA4.0mg/L+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L;生根阶段适宜培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+活性碳0.1%.蜻蜓凤梨组培苗容易移栽成活,移栽成活率可达95%以上.

蜻蜓凤梨叶片组织培养植株再生的研究

以蜻蜓凤梨试管苗叶片为外植体进行离体再生研究。结果表明,叶片诱导直接分化不定芽的最佳培养基是MS+BA 5.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L,分化率高达80%。增殖培养基为MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。壮苗培养基为MS+NAA 2.0 mg/L。生根培养基为MS+NAA 2.0 mg/L+AC 0.5 g/L,生根率达100%。

蜻蜓凤梨开花相关基因AfFPF1初步研究

FPF1(flowering-promoting factor 1)是参与植物开花期遗传控制的重要家族之一。迄今为止,人们对蜻蜓凤梨中FPF1家族了解有限。本研究以热带花卉蜻蜓凤梨为材料,基于转录组测序数据,克隆获得Af FPF1基因。该基因编码的蛋白含103个氨基酸,分子质量为12.06 kD。Af FPF1转录本在蜻蜓凤梨的根中显著高表达,此外其表达量受外源乙烯强诱导,且响应赤霉素。Af FPF1基因在拟南芥中异位表达使其开花时间提前,莲座叶数目减少,促进其根系生长。对转基因拟南芥内源开花基因进行表达量检测,发现转基因植株中,一些开花促进基因如AtFT、AtAP1、AtLFY、AtFUL、AtSOC1表达量显著升高,而抑制开花基因AtFLC表达量下调,进一步证实Af FPF1能正调控拟南芥的开花时间,且可能与这些基因相互作用。研究结果初步证实Af FPF1可能参与调控蜻蜓凤梨开花过程,为进一步研究Af FPF1功能、通过基因工程调控蜻蜓凤梨开花以及乙烯诱导蜻蜓凤梨开花分子机制提供了理论依据。

蜻蜓凤梨AfPIN的克隆、载体构建及遗传转化

本研究以蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)为材料,利用RACE技术克隆到跟生长素输出载体同源的基因,命名为Af PIN。序列比对分析表明:Af PIN推测的氨基酸序列含有PINs的IM(internalization motif)保守结构和一个高度保守的生长素输出载体(auxin efflux carrier,AEC)蛋白结构域,与番茄(Solanum lycopersicum)、豌豆(Pisum sativum)、芥菜(Brassica juncea)、小麦(Triticum aestivum)的PIN同源性分别为67%、67%、60%和67%。本研究构建了Ca MV-35S-GUS-Af PIN表达载体,利用农杆菌介导法侵染拟南芥花序,通过GUS染色和PCR检测,结果表明表达载体构建成功并成功转入拟南芥中。本研究已从蜻蜓凤梨中成功的克隆出Af PIN、构建了Ca MV-35S-GUS-Af PIN表达载体并转化到拟南芥中,为研究Af PIN的基因功能和乙烯诱导凤梨科植物开花机理奠定基础。

蜻蜓凤梨AfAG基因的克隆、载体构建及遗传转化

本研究以蜻蜓凤梨为材料,利用RACE技术获得一个与拟南芥AGAMOUS(AG)同源的编码基因c DNA,并将其命名为Af AG。Af AG基因的c DNA全长1 422 bp,开放阅读框为723 bp,可翻译成240个氨基酸。利用NCBI对Af AG蛋白进行序列分析,结果显示Af AG蛋白含有MADS-box蛋白家族共有的功能结构域:MADS和K-BOX两个结构域。与水稻(Os AG);玉米(Zm AGL);拟南芥(At AG);菜心(Br AGL);椰子(Cn AGL);白兰花(Ma AGL)的同源性比对结果分别为65%、63%、68%、65%、83%、75%。本研究成功构建了Ca MV35S-Af AG过表达载体,用农杆菌介导的方法将表达载体成功转入到拟南芥中,为进一步研究蜻蜓凤梨开花分子机理提供了理论依据。