嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与序列分析

以嗜水气单胞菌BZ和NK分离株的DNA为模板，采用PCR技术，扩增气溶素基因（aerA）的DNA片段，将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定，分析结果表明-所克隆的1393bp片段为aerA部分序列，编码产生464个氨基酸。BZ与NK之间aerA核苷酸同源性为97．6％，氨基酸同源性为98．3％，与其它分离物核苷酸同源性为71．6％～97．5％，氨基酸同源性为68．0％～98．9％。利用邻接法构建了aerA分子树状图，树状图分析表明：气单胞菌属各分离物聚为三支，其中嗜水气单胞菌各菌株之间关系密切，被聚类为同一支。

欧鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因序列分析

对克隆的欧鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因AHL316HEM进行序列和结构分析表明,AHL316HEM基因读码框架全长为1 482 bp,编码长度为493个氨基酸的蛋白,分子量为54.2 kD,等电点为5.625,读码框架内有一个EcoRI酶切位点。AHL316HEM从起始位点至第23个氨基酸残基形成一明显疏水区,可能构成信号肽,其抗原位点大部分都在亲水区,不具穿膜性。同源性分析表明,AHL316HEM基因编码的氨基酸序列与已报道的嗜水气单胞菌溶血素基因(accession No.BAA83088)的同源率为98％,与斑点气单胞菌溶血素基因(accessionNo.U40711)、温和气单胞菌溶血素基因(accession No.AF443393)的同源率分别为84％和72％,与霍乱弧菌溶血素基因(accession No.AF540655)、副溶血弧菌溶血素基因(accession No.VIBTRH2A)、金黄葡萄球菌β-溶血素基因(accession No.S72497)的同源性分别为7％、5％和4％。这一结果提示,气单胞菌属内各菌种的溶血素基因可能有共同的起源。

林蛙嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆、分析及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,采用PCR方法,扩增出与预期设计的740 bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,所克隆的目的基因的核苷酸长为740 bp,共编码246个氨基酸。该基因片段与已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列同源性为98.78%,氨基酸同源性为98.78%。利用生物信息学和分子生物学软件,对嗜水气单胞菌外膜蛋白的结构进行预测,结果表明其为外膜孔蛋白。本试验为嗜水气单胞菌外膜蛋白的表达及基因工程疫苗的研制奠定了基础。

嗜水气单胞菌AH10(CCTCC AB2014155)的全基因组测序及比较分析

为了解嗜水气单胞菌全基因组信息的结构和功能,对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)AH10(CCTCC保藏号:AB2014155)进行了全基因组测序。将提取的AH10全基因组DNA进行片段化、构建文库后上机测序;将基因组组装后进行注释和比较分析。结果显示:AH10全基因组序列总长度为4.91 Mb,GC含量为61.1%,共预测到4570个基因,3351个基因具有明确的生物学功能。共找到2592个基因具有直系同源族(cluster of orthologous groups,COG)分类,1281个与代谢通路有关的基因,基因组岛31个。比较基因组学研究发现:AH10比对到SNP位点102481个,与Aeromonas hydrophila YL17基因结构共线性最好,与美国来源的嗜水气单胞菌标准菌株Aeromonas hydrophila ATCC 7966具有较近的亲缘关系,AH10的致病性与溶血素基因hly(hemolysin gene)、气溶素基因aer(aerolysin gene)、黏附素基因ahal(major adhesion gene)、丝氨酸蛋白酶基因ahp(serine protease gene)、细胞兴奋性肠毒素基因alt(cytotonic enterotoxin gene)密切相关。这些基因在嗜水气单胞菌中同源性较高。存在自体诱导物信号分子-2(autoinducer-2)与合成信号分子酶基因(signal molecule synthetase gene,ahy Ⅰ)和转录调节蛋白基因(transcriptional regular gene,Ahy R)群体感应(quorum sensing,QS)系统,不存在Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)。通过对AH10全基因组序列进行较为全面的注释和比较统计分析,为嗜水气单胞菌的分子生物学研究提供理论支持。

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构。根据G enB ank中aer毒素的基因序列(M 16495),设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pM D 18-T载体克隆。酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M 16495的同源性达92%,将测得的序列登录G enB ank数据库,所得的序列编号为AY 136943。分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示:其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M 16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%。证明aer毒素基因的5′端保守,3′端变异较大。

鳗源嗜水气单胞菌L316主要外膜蛋白基因克隆和序列分析

根据已发表嗜水气单胞菌(AH)的外膜蛋白基因(Omp)的核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR 技术,扩增AHL316的主要外膜蛋白基因(Momp),经T/A克隆,插入到pGEM—T系列载体上进行序列测定,结果表明Momp基因最长的开放阅读框(ORF)为1 035 nt,编码由分子量为36 kD的主要外膜蛋白(MOMP),其与国外AH分离株AF146597的Omp基因的核苷酸的同源性达96%,氨基酸的同源性达98%。应用分子生物学软件分析表明此主要外膜蛋白前24个氨基酸是较强的疏水性区域,可形成信号肽,有跨膜区,经与其他外膜蛋白系统发育进化分析表明,该蛋白属于ompA蛋白家族。

维氏气单胞菌吉林分离株外膜蛋白AⅡ基因的克隆及生物信息学分析

目的克隆维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,AV)吉林株外膜蛋白AⅡ(OMPAⅡ)基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。方法根据维氏气单胞菌已知OMPAⅡ基因序列设计合成一对引物,通过PCR技术扩增OMPAⅡ基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定,通过BlastN分析维氏气单胞菌OMPAⅡ基因序列与其他菌种OMPAⅡ序列同源性,并构建系统进化树,同时对维氏气单胞菌OMPAⅡ蛋白进行生物信息学分析。结果克隆基因长1 001bp,与GenBank报道的基因序列同源性为95%,生物信息学软件分析OMPAⅡ蛋白无跨膜区,其N端含有1个信号肽,二级结构以β折叠和β转角为主,有10个区域可能存在B细胞抗原表位。结论成功的克隆维氏气单胞菌OMPAⅡ基因,并对OMPAⅡ蛋白的相关生物信息学进行了分析。

嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因的检测与序列分析

对分离于草鱼、青鱼、鲤鱼、牙鲆、宽体金线蛭、中国林蛙的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hy-drophila),进行Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,TTSS)AscV基因的检测与分析,探讨不同来源嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因的携带与分布情况。利用文献发表的TTSS的AscV基因特异性引物,采用PCR方法扩增该基因片段,选取代表菌株的AscV基因序列,以DNA Star软件与GenBank公布的参考菌株相应基因序列进行同源性比较,构建系统进化树。结果在供试的42株菌中,有34株携带(阳性率80.95%);其中分离于宽体金线蛭的10株有8株携带(阳性率80%)、中国林蛙的11株有10株携带(阳性率90.9%)、牙鲆的10株有9株携带(阳性率90%)、草鱼的7株有3株携带(阳性率42.9%)、青鱼和鲤鱼的各2株均携带(阳性率100%)。所检测的5个代表菌株AscV基因与参考菌株的同源性在81.0%～98.7%之间;供试不同来源菌株之间的同源性在91.2%～99.3%之间。

剑尾鱼趋化因子CCL4和CCL19基因的克隆及嗜水气单胞菌感染对其组织表达的影响

趋化因子是一类能够吸引白细胞移行到感染部位的低分子量(8~10 ku)蛋白质,在炎症反应、非特异性免疫反应中具有重要作用。实验克隆了剑尾鱼2个趋化因子基因(CCL4、CCL19)c DNA序列,运用荧光定量PCR技术检测其在健康组织和嗜水气单胞菌感染后肝、脾中的表达情况。结果显示,剑尾鱼CCL4和CCL19开放阅读框长度分别为294和333 bp,分别编码97和110个氨基酸,推导氨基酸序列均含有趋化因子CC家族标志性的4个半胱氨酸残基,与其他物种尼罗罗非鱼、鼠、狗、人、鸡的氨基酸序列相似性比较,CCL4相似度分别为71.1%、33%、33%、31%、23.5%;CCL19相似度分别为62%、26.9%、24.5%、26.6%、27.8%。在检测的健康剑尾鱼8个组织中,CCL4和CCL19均有表达,其中CCL4和CCL19均在脾脏中表达量最高;CCL4在肌肉和肠中表达量较低,而CCL19则在心脏中表达量较低。经嗜水气单胞菌感染后,CCL4在剑尾鱼头肾中12 h表达量达到最高,在肝脏中24 h表达量最高;CCL19在头肾和肝脏中均在24 h时表达量最高。研究表明,趋化因子CCL4和CCL19可能参与剑尾鱼机体免疫调节反应,在抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥了重要作用。

不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析

采用PCR方法,对分离于发病宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲤(Cyprinus carpio)的42株致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了外膜蛋白(OMP)基因的检测;将代表菌株的外膜蛋白基因通过DNAStar软件与GenBank中报道的4株嗜水气单胞菌(FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和1株温和气单胞菌(A.sobria,FJ437029.1)参考菌株进行了核苷酸同源性比较分析。结果表明,所检不同来源嗜水气单胞菌的OMP基因携带率为100%;所测代表菌株的OMP基因与参考菌株的同源性在86.0%～99.2%之间。所测得的不同来源嗜水气单胞菌OMP基因的同源性98.3%～100%,其中分离于宽体金线蛭的HTQ010505-1与青鱼的HL060811-4两菌株间同源性高达100%。

6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素(aerolysin,aer)、溶血素(haemolysin,hly)、丝氨酸蛋白酶(serine protease,ahp)、热稳定细胞肠毒素(heat-stable cytotonic enterotoxin,ast)和热敏感细胞肠毒素(heat-labile cytotonic enterotoxin,alt)5种毒力基因,且使用Mega 5.2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16S rDNA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性,aer、hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。

林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆及原核表达

以长白山林蛙中分离的嗜水气单胞菌为材料,对嗜水气单胞菌气溶素基因进行克隆、序列分析及基因表达等研究,为嗜水气单胞菌的分子生物学研究提供依据。通过实验成功克隆了气溶素基因,大小为1163bp,对其进行同源性检测,与基因库中DQ186611基因序列的同源性高达99%;构建原核表达重组质粒pGEX-Aer,在大肠杆菌BL21中获得表达,蛋白分子量约为69ku,以包涵体形式存在。