结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值

目的获得重组抗原85A(rAg85A),研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白,通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物(PPD)或纯化的rAg85A蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果重组质粒pET30a-Ag85A测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的2％左右,Western印迹分析它与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化的rAg85A样品纯度约85％左右,每100 ml培养菌可获得2 mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值+2s为正常界限值,一步法的特异性和敏感性分别为87.9％和65.6％;PPD分别为93.9％和62.5％;rAg85A分别为93.9％和15.6％。结论pET30a-Ag85A大肠杆菌工程菌能以包涵体形式表达rAg85A蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性,但检测抗结核抗体的灵敏度低。

结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究

目的 构建编码结核分枝杆菌蛋白Ag85A基因为基础的DNA疫苗。 方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因组中 ,扩增出分泌蛋白Ag85A成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后 ,插入克隆载体 pGEM TEasy中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3.1的相应酶切位点。重组质粒肌注免疫小鼠 ,4周后用ELISA法检测抗体滴度。结果 结核分枝杆菌H37Rv株Ag85A成熟蛋白的编码基因经序列测定证实无突变 ;经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定证实克隆基因正确插入载体 pcDNA3.1。ELISA法检测几何平均滴度为 1∶10 0 0。结论 以Ag85A成熟蛋白的编码基因为基础的DNA疫苗的成功构建和表达 。

牛分枝杆菌Ag85A基因的克隆及序列分析

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板 ,以Ag85A成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增 ,获得了 90 0bp的DNA片段。通过T A克隆技术 ,将PCR产物克隆至pGEM T载体。经鉴定 ,成功地构建出了克隆载体pGEM T 85A。

牛分枝杆菌Ag85A基因在大肠埃希氏菌中的表达

以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切已构建的pGEM-T-85A和pET28a(+),并将纯化的Ag85A基因亚克隆至pET28a(+)中,构建出原核表达质粒pET28a-85A。将pET28a-85A转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约32 ku的外源蛋白带。Western-blotting分析表明,该蛋白具有牛分枝杆菌的抗原性。

结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察

目的:构建编码结核分枝杆菌Ag85A分泌蛋白重组真核表达质粒,研究其与hIL-12联合免疫小鼠后的细胞免疫应答。方法:(1)构建质粒:采用PCR法从H37Rv菌株中扩增Ag85A编码基因,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体PMD20-T中,经酶切鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于真核表达载体PCDNA3.1的相应酶切位点。(2)动物实验:50只C57BL/6N小鼠随机分为:①Ag85A基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组);②重组Ag85A基因疫苗组;③卡介苗BCG组(阳性对照);④空载体组(阴性对照);⑤PBS组(空白对照)。基因疫苗、空载体和PBS经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次,约0.3 ml/只。第三次免疫小鼠后28天,处死各组小鼠,分离脾细胞,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFNγ-、IL-2、IL-4水平;乳酸脱氢酶释放法检测脾细胞杀伤活性;分离的脾细胞经TB-PPD刺激后,XTT比色法检测脾淋巴细胞增殖活性。结果:(1)成功构建结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗。(2)联合免疫组能诱导较强烈的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-r和IL-2水平显著高于Ag85A基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少;特异性CTL杀伤活性明显增强;淋巴细胞增殖活性也明显高于其他组别。结论:hlL-12表达质粒能够增强结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗所诱导的小鼠免疫应答。

人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达

目的构建人结核杆菌热休克蛋白65(Hsp65)与Ag85A基因的共表达载体pIRES-Hsp65-Ag85A,并检测其在体外的表达。方法利用聚合酶链反应(PCR)法及基因重组技术,以人结核杆菌基因组DNA为模板,扩增获得Hsp65与Ag85A的全长基因,并将其构建到真核表达质粒pIRES中获得共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A。将该质粒转染Hela细胞,通过RT-PCR的方法检测目的基因的表达。结果经过测序证实重组质粒构建成功,该质粒在体外转染Hela细胞后可表达Hsp65与Ag85A两者的mRNA。结论成功构建了共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A,该质粒能在人子宫颈癌细胞中表达。