结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8及 1.0 μg重组抗原分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8及 72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5IUPPD及 0 .4、0 .6、0 .8、1.0 μgAg85A抗原 ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部一侧 ,每批 6只 ,共 3批。于注射后 2 4、4 8、72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。结果 :常规皮肤试验 0 .1、0 .2 μg重组Ag85A抗原诱发DTH的平均直径与PPD相比有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,而 0 .4、0 .6、0 .8、1.0重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比 ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后结果与常规皮肤试验结果一致。结论

稳定表达Ag85A蛋白细胞系的建立

目的建立稳定表达Ag85A蛋白的K562真核细胞系,为进一步开展以阳离子脂质体为转运载体的口服疫苗的免疫原性研究奠定基础。方法将已构建的重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A包裹阳离子脂质体LipofectamineTM 2000后,转染真核细胞K562,SDS-PAGE和Western blot分析重组Ag85A蛋白的表达。用G418筛选稳定表达Ag85A蛋白的细胞株,流式细胞术和间接免疫荧光技术检测Ag85A蛋白的表达及定位。结果重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A转染K562细胞时,与脂质体的最适比例为2μg:2μl;转染细胞表达的Ag85A蛋白相对分子质量约为32000,且具有良好的反应原性。稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞有42.37%的细胞显示FITC标记,且细胞胞浆中及细胞膜上均有Ag85A蛋白的表达。结论已获得稳定表达Ag85A蛋白的K562细胞系,可用于Ag85A蛋白的大量制备及抗体方面的研究。

Ag85A蛋白特异性细胞免疫反应对结核性胸膜炎的辅助诊断价值

目的:探讨Ag85A蛋白特异性细胞免疫反应对结核性胸膜炎的辅助诊断价值。方法:原核表达、纯化Ag85A蛋白。收集我院收治的胸腔积液患者149例,分为结核性胸膜炎组100例,非结核性胸膜炎组49例,收集胸水样本。ELISA法检测胸水样本上清成分内抗Ag85A抗体表达水平;将Ag85A蛋白刺激胸水样本细胞成分,检测IFN-γ表达水平的变化。结果:2组胸水中抗Ag85A抗体均未明显升高;经Ag85A蛋白刺激后,结核性胸膜炎组IFN-γ表达明显增加,平均(1 151.25±217.81)μg/L,非结核性胸膜炎组IFN-γ表达未明显增加,平均(14.00±1.02)μg/L(P<0.01)。结论:结核性胸膜炎胸水样本中细胞成分经Ag85A抗原刺激后IFN-γ的表达明显增加,该方法对结核性胸膜炎的辅助诊断有一定的价值。