结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达,以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体,双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子,阳性重组子转化大肠杆菌,并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达,对染色的凝胶扫描,以测定目的蛋白表达水平。结果菌体蛋白经SDSPAGE,含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带,表达量占菌体总蛋白的33%～38%。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。

牛分枝杆菌Ag85B基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,根据已发表的Ag85B成熟蛋白基因的核苷酸序列设计合成特异性引物进行PCR扩增,获得约860bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-85B。以BamH和EcoR双酶切pGEM-T-85B和pET28a(+),并将纯化的Ag85B基因亚克隆至pET28a(+)中,构建出原核表达载体pET28a-85B。将pET28a-85B转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约30000的外源蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究Ag85B的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。

结核杆菌Ag85B基因疫苗与结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的比较结核杆菌Ag85B基因疫苗与结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫效应,为研制高效结核杆菌基因疫苗奠定基础。方法将雌性C57BL/6健康小鼠54只,随机分为3组,即结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗(pIRES-Ag85B/GM-CSF)组、结核杆菌Ag85B基因疫苗(pIRES-Ag85B)组和空载体(pIRES)组,分别小鼠肌内注射疫苗,检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标,同时另取C57BL/6小鼠,随机分成4组,第1、2、3组免疫方法与上述各组免疫方法相对应,第4组每只小鼠背部皮下注射1×106CFU卡介苗(BCG),作为阳性对照,进行动物免疫保护性实验,比较分析两种基因疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗在小鼠体内的免疫原性和免疫保护性明显强于结核杆菌Ag85B基因疫苗。结论结核杆菌Ag85B和细胞因子GM-CSF共表达基因疫苗能增强结核病基因疫苗的免疫原性和免疫保护性。

携带结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体的构建及鉴定

构建包含结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体,并转化农杆菌LBA4404。以pcDNA3-Ag85B为模板,通过常规PCR克隆出Ag85B基因,定向克隆至含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,然后将globulin-1-Ag85B的融合片段酶切下来,并连接到经过加工修饰的含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。重组质粒双酶切可见0.8bp和10kb的两条特异性条带,与预期大小相一致。重组质粒测序表明克隆的Ag85B基因序列与Genbank上相一致,酶切从农杆菌中所抽提的质粒,片段大小与预期相一致。成功构建与转化了携带结核Ag85B基因的植物双元表达载体,为利用植物反应器生产口服结核疫苗奠定基础。

牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达

[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD-NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85b DNA疫苗奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建

目的:克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,为进一步研究其在开发新型的结核病疫苗和结核病免疫诊断试剂奠定了基础。方法:采聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因,然后用双内切酶消化PCR产物和pIRES质粒,用T4 DNA连接酶连接后,转化入感受态E.coli DH5a,产物铺AmpR抗性的平板,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定并进入blast网页比对测序的序列。结果:酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序比对后结果与目的基因完全一致,证实符合表达框架。结论:成功地克隆并构建Ag85B基因的真核重组表达质粒pIRES-Ag85B。

结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B基因的克隆及表达

目的 对分支杆菌的一种分泌蛋白Ag85B的基因进行克隆、表达 ,为结核病进行诊断打下基础。 方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,以PCR法对基因ag85b进行扩增 ,产物与载体质粒 pET2 4b构建表达Ag85B的重组质粒 ,将此重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内 ,抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主大肠杆菌JM 1 0 9(DE3)菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达 ,所表达的蛋白质分相对分子质量为 30 0 0 0。结论 目的基因克隆入宿主菌内 ,重组结核杆菌分泌蛋白Ag85B的成功表达为进行临床诊断试验奠定了基础。

牛结核分枝杆菌Ag85b基因的克隆及表达

牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是引起牛结核病的病原,结核病是一种重要的人畜共患的慢性传染病,可通过病畜传染给人类或其它动物;Ag85B是分枝杆菌主要的保护性抗原.以人型和牛型结核分枝杆菌基因组DNA为模板,对靶基因Ag85B进行扩增,构成重组表达质粒,并在大肠杆菌进行诱导表达.为Ag85B蛋白用作结核病检测和疫苗侯选抗原研究奠定了基础.

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(SOE-PCR)获得了融合基因22-ag85B,将基因连接于表达载体pET32a(+),构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1mmol/L)诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。

牛分枝杆菌与鸟型分枝杆菌2型重组蛋白Ag85b的血清学交叉反应研究

牛分枝杆菌(M.bovis)是引起牛结核病的常见病原,而鸟分枝杆菌(M.avium)2型则通常交叉感染牛,但不会导致严重的病变。为鉴定M.bovis和M.avium的免疫交叉反应情况,本研究分别以M.bovis和M.avium2型的基因组为模板,扩增ag85b基因,分别构建了M.bovis和M.avium的原核和真核表达重组质粒进行表达。以原核表达纯化的两种重组蛋白Ag85b(rAg85b)分别作为包被抗原,交叉检测两种真核重组质粒免疫豚鼠制备的抗血清。结果表明,原核表达的M.bovis和M.avium rAg85b与真核重组质粒免疫豚鼠制备的两种抗血清之间存在较强的免疫交叉反应。研究结果揭示M.bovis和M.avium的Ag85b蛋白存在很强的血清学交叉反应,这将严重干扰M.bovis Ag85b作为候选疫苗的免疫监测。

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的:构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP/Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法:常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0.3mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside熏IPTG)诱导表达产生融合蛋白(MBP/Ag85B),Westernblot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂(Amyloseresin)对MBP/Ag85B融合蛋白纯化。结果:重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ/HindⅢ酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40%;Westernblot显示,MBP/Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amyloseresin纯化后,MBP/Ag85B融合蛋白的纯度可达95%以上。结论:成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。

实时定量qPCR检测耐异烟肼结核分枝杆菌Ag85B和38ku蛋白mRNA表达水平

目的运用实时定量qPCR(quantitative real-ti me PCR)检测结核分支杆菌耐异烟肼菌株和敏感株Ag85B和38 ku蛋白编码基因(fbpB、psts1)的表达水平,分析结核分支杆菌耐异烟肼株和敏感株的蛋白抗原在转录水平的差异性。方法根据GenBank提供的序列,设计目的基因fbpB、psts1及内参基因Sigа的特异引物,将fbpB、psts1及Sigа扩增片段克隆入载体pMD18-Tsi mple,重组质粒经纯化及倍比稀释,应用实时定量PCR检测22株耐异烟肼菌株及25株敏感菌株(含H37Rv标准株)中fbpB、psts1的表达水平。结果耐异烟肼菌株的fbpB表达水平为0.65±0.22,敏感菌株fbpB表达水平为0.36±0.13,差异有统计学意义(t=5.683,P<0.01);耐异烟肼菌株的psts表达水平为13.63±4.16,敏感菌株psts1表达水平为9.86±2.79,差异有统计学意义(t=3.869,P<0.01)。结论应用实时定量PCR检测耐异烟肼菌株的fbpB、psts1的表达水平显著高于敏感菌株,为耐药结核的实验室诊断提供分子标识。