牛分枝杆菌Ag85B的生物信息学分析及多表位候选抗原的构建

为了构建基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,试验采用生物信息学方法对Ag85B蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构等进行分析,预测其T、B淋巴细胞抗原表位,并构建以pET-28a(+)为载体的多表位候选抗原,分析预测多表位候选抗原的理化性质、抗原性并进行免疫模拟。结果表明:Ag85B蛋白有325个氨基酸残基,相对分子量为34.58085,理论等电点为5.62,脂肪系数为72.18,亚细胞定位于线粒体、细胞质和高尔基体中,具有亲水性、信号肽和跨膜结构域,属于分泌型蛋白,其无规则卷曲和β-转角结构的占比分别28.15%和8.62%,含有3个T淋巴细胞优势表位和8个B淋巴细胞优势表位。构建的Ag85B多表位候选抗原为亲水性蛋白和非致敏原,两次预测免疫原性参数分别为0.893和1.524,可诱导特异性的体液和细胞免疫应答。说明试验成功构建出基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,且该多表位候选抗原可能诱导机体产生T、B淋巴细胞免疫应答。

结核分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

为制备结核分枝杆菌Ag85B的多克隆抗体,采用微针注射法将前期构建好的真核表达质粒pcD-Ag85B经大腿肌肉免疫SD大鼠;采用间接ELISA法检测抗体滴度;初免后42 d,经腹主动脉取血并分离血清,采用Protein G柱分离纯化Anti-Ag85B抗体并鉴定抗体的特异性。初免后14 d、28 d、42 d的血清抗体平均效价分别为1∶747、1∶2 240、1∶2 667;分离纯化出高纯度且特异性高的anti-Ag85B抗体。成功获得了大鼠Anti-Ag85B多克隆抗体,为进一步研究Ag85B的功能和诊断结核病奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫

目的 研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法 以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论 应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 .

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的 研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法 用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论 Ag85

结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins,CFP)作为抗原 ,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度 .为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答 ,最后一次免疫完成后 4wk ,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞 ,体外用抗原刺激 ,MTT法检测淋巴细胞刺激反应 ,ELISA检测悬液中IFN γ水平 .另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv ,4wk后计数脾脏细菌负荷数 .结果 :Ag85B ESAT6蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶10 0 0 ,ESAT6 Ag85B蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶5 0 0 0 .融合蛋白Ag85B ESAT6和ESAT6 Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为 2 .4 0± 0 .17和 2 .6 0± 0 .2 5 ,而生理盐水组只有 0 .90± 0 .2 1;相对应的IFN γ含量分别为 (3.5 1± 0 .30 ) μg/L和 (4 .0 5± 0 .4 1) μg/L ,显著高与生理盐水对照组 (0 .5 0± 0 .2 5 ) μg/L ,P <0 .0 5 ,但不及BCG免疫组 (5 .5 5±0 .31) μg/L .与生理盐水免疫组 (细菌负荷6 .31± 0 .13)相比较 ,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠 。

TAT-Ag85B蛋白疫苗的制备和抗结核分枝杆菌效果评价

目的探讨利用HIV反向转导结构域(TAT-PTD)系统表达的转导性Ag85B蛋白疫苗的抗结核分枝杆菌效应。方法构建p ET28a-Ag85B、p ET28a-TAT-Ag85B质粒,原核表达纯化和鉴定后获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;将BALB/c小鼠随机分为3组:Ag85B组,TAT-Ag85B组,PBS组。重组蛋白经皮下免疫小鼠3次,末次免疫后1周处死部分小鼠,ELISA检测小鼠血清中Ag85B抗体滴度,以及脾细胞分泌的γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)的水平;用流式细胞术检测巨噬细胞经Ag85B、TAT-Ag85B蛋白刺激后表面分子CD80、CD86变化情况;剩余小鼠经尾静脉感染H37Rv结核分枝杆菌,感染后第1、2、4、8周动态监测小鼠肺和脾内结核分枝杆菌载量,并在感染后8周取肺脏进行HE染色,观察肺组织病变情况。结果成功获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;与Ag85B相比,TAT-Ag85B诱导小鼠表达高水平的Ig G和IFN-γ、IL-2,感染小鼠的脾、肺结核分枝杆菌载量明显减少,肺组织病变范围小、结核分枝杆菌数量少。另外,TAT-Ag85B增强巨噬细胞表面分子CD80/CD86的表达。结论 TAT-Ag85B蛋白疫苗增强巨噬细胞的抗原提呈能力,诱导小鼠产生强烈的Th1免疫应答,有一定的抗结核分枝杆菌保护作用。

结核分枝杆菌重组Ag85A、Ag85B蛋白免疫原性的研究

目的研究结核分枝杆菌重组Ag85A(rAg85A)和/或Ag85B(rAg85B)蛋白与母牛分枝杆菌菌苗(Mycobacteri-um vaccae,MV)联合免疫的免疫原性。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机分为下列6组:(1)阴性对照组:磷酸盐缓冲液(PBS)组,(2)阳性对照组:卡介苗(BCG)组,(3)阳性对照组:MV组,(4)实验组:rAg85A-MV组,(5)实验组:rAg85B-MV组及(6)实验组:rAg85A-rAg85B-MV组。每2周免疫1次,共免疫3次。末次免疫结束后第14天杀鼠,用ELISA法检测血清中IgGI、gG1和IgG2a水平;ELISPOT检测脾脏分泌γ干扰素(IFN-γ)的T淋巴细胞斑点数;流式细胞术检测全血单个核细胞内Th1和Th2百分比。结果三个实验组小鼠血清抗体水平均明显高于三个对照组(P<0.001);三个实验组和两个阳性对照组小鼠的T淋巴细胞斑点数均明显高于阴性对照组(P<0.05);rAg85A-rAg85B-MV组小鼠Th1百分比明显高于其余五组(P<0.001),三个实验组Th1/Th2比值均明显高于三个对照组(P<0.05)。结论结核分枝杆菌rAg85A和rAg85B蛋白均具有很强的免疫原性,与MV联合免疫可增强其Th1型细胞免疫应答。

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(SOE-PCR)获得了融合基因22-ag85B,将基因连接于表达载体pET32a(+),构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1mmol/L)诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B/GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建结核分枝杆菌Ag85B/GST融合蛋白表达质粒 ,并在大肠杆菌 (E .coli)中诱导表达。方法 以质粒pUC18/Ag85B为模板 ,用PCR法扩增结核杆菌Ag85B基因 ,扩增的Ag85B上游含有EcoRⅠ酶切位点 ,下游含有SalⅠ酶切位点 ;将Ag85B基因定向插入质粒pGEX 4T 1中 ,构建原核表达质粒pGEX Ag85B并转化E .coliBL2 1,筛选阳性重组子 ,限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定 ,异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot鉴定结果。结果 成功构建原核表达质粒pGEX Ag85B并表达出Mr 约 5 6 0 0 0大小的Ag85B/GST融合蛋白 ,表达量占总菌体的 30 %。

结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白的原核表达、纯化、鉴定及活性初步测定

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白,并对其进行纯化、鉴定和活性初步测定.方法将构建的pGEX-Ag85B/IL-2重组菌BL21扩增后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间;梯度浓度尿素复性包涵体,经GST-Sepharose亲和层析、凝血酶切、阴离子交换层析和反相-高效液相(RP-HPLC)层析纯化Ag85B/IL-2融合蛋白,免疫印迹(Westernblot)鉴定,并测定其N-末端氨基酸序列和IL-2比活性.结果成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的Ag85B/IL-2融合蛋白,占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达,于诱导后6h表达量达最高峰.对包涵体复性,纯化获得纯度为98.32%的Ag85B/IL-2融合蛋白,Westernblot鉴定阳性,N-末端氨基酸测序与理论预期完全一致,IL-2比活性为2500u/mg.结论高效表达并纯化了Ag85B/IL-2融合蛋白,为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础.

牛结核分枝杆菌抗原蛋白Ag85B的表达及纳米疫苗的制备

以牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis,MTB)C68001株基因组DNA为模板,克隆免疫优势抗原基因Ag85B,构建重组表达质粒p ET-28a-ag85b,转化入大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。以明胶为佐剂,Ag85B为目的抗原制备纳米疫苗,并对其进行了相关的工艺检测。以BCA法建立测定蛋白质含量的标准曲线,在此基础上检测纳米疫苗的载药率和包封率。结果显示,明胶佐剂疫苗的载药率为71.83%,包封率为41.03%,符合纳米疫苗的工艺要求。

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立

建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3,构建了Ag85B-ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815(H-2d)细胞。通过G418压力筛选后,得到1株阳性克隆细胞。经过BT-PCR检测到该细胞中有 Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光,证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达质粒 pCDAg85B A ,酶切、DNA测序鉴定 ,用脂质体法将 pCDAg85B A转染COS 7细胞 ,采用RT PCR ,ELISA方法检测其表达 .结果 :Ag85B Ag85A融合基因定向克隆入pcDNA3.1 (+) ,双向测序表明碱基无突变 ,Ag85B Ag85A融合基因在真核细胞中能表达 .结论 :成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 。

结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建

目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体 pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3的相应酶切位点。结果结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实 ,与Erdman株完全一致 ;用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实 ,克隆基因正确插入载体pcDNA3。结论以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究

目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。

结核分枝杆菌H37Rv两种抗原Ag85b、HspX的制备及其与佐剂的联合应用

目的用分子生物学方法制备H37Rv的两种抗原Ag85b、HspX,通过与铝佐剂和CpG佐剂联用免疫小鼠进行初步药理学实验以观察其生物学活性。方法常规方法分别构建重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,内切酶鉴定目的片段后两种质粒分别转化BL-21大肠杆菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后分别产生两种蛋白;用阴离子交换柱Source30、QHP以及疏水层析柱对两种蛋白进行纯化;蛋白测序进行鉴定。纯化后的两种蛋白分别与铝佐剂和CpG佐剂联用(Ag85b,Ag85b+Al,Ag85b+CpG,Ag85b+Al+CpG;HspX,HspX+Al,HspX+CpG,HspX+Al+CpG),免疫C57/BL小鼠,同时设置生理盐水对照组,取脾细胞进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测干扰素-γ(IFN-γ)的分泌;同时进行淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞经体外刺激后的增殖情况。结果成功构建了两种重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,成功诱导表达了两种蛋白;经过纯化,两种蛋白纯度均达到95%;经鉴定两种蛋白纯化产物的N端15个氨基酸序列与目的序列相同;Ag85b+CpG、Ag85b+Al和Ag85b+CpG+Al组经Ag85b(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05);HspX+CpG+Al组经HspX(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05)。结论成功表达并纯化了结核分枝杆菌H37Rv的两种抗原Ag85b和HspX,与铝佐剂和CpG佐剂联用后成功刺激小鼠产生了细胞免疫反应,证实了两种重组蛋白的生物学活性,为下一步药效学评估奠定了基础。