江浙蝮蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的研究 Ⅱ.对鼻咽癌细胞活力、增殖、迁移和细胞形态的影响

目的:将江浙蝮蛇粗毒中新分离纯化的一种精氨酸酯酶Agkihpin应用于鼻咽癌细胞LXC的体外培养,观察Agkihpin对鼻咽癌细胞活力、增殖、迁移和细胞形态的影响,以期探索治疗鼻咽癌的新方法、新药物。方法:将不同剂量的Agkihpin加入细胞培养液中,用四甲基偶氮唑(MTT)法分析细胞活力,细胞计数法观察和分析细胞增殖和细胞迁移。结果:一定剂量的Agkihpin可抑制LXC的细胞活力、增殖、迁移,并可改变细胞形态和杀伤LXC,且剂量越大抑制、杀伤和细胞形态改变越明显。结论:Agkihpin对鼻咽癌的治疗具有潜在的重要意义,Agkihpin具有作为抗鼻咽癌新药物的开发潜力。

蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin基因的克隆及原核表达

目的构建蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的原核表达载体,并诱导其表达重组Agkihpin,为将来量产Agkihpin提供方法和依据。方法 RT-PCR法扩增Agkihpin基因,构建重组表达质粒p ET30a(+)-Agkihpin和p EASY-E1-His6-Agkihpin,并转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳观察重组蛋白Agkihpin的表达情况,Western blot检测其特异性。结果成功构建Agkihpin的原核表达载体p EASY-E1-His6-Agkihpin和p ET30a(+)-His6-Agkihpin,并利用p EASY-E1-His6-Agkihpin首次在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出分子量约为30k D的His6-Agkihpin重组融合蛋白。结论首次实现了His6-Agkihpin重组融合蛋白在原核系统中的高效表达,为Agkihpin将来量产提供了方法和实验依据。

新重组蛇毒类凝血酶r-agkihpin-1的抗血栓活性

目的探讨重组agkihpin将来作为抗血栓药物的可能性,为将来把重组agkihpin做成抗血栓药物提供实验依据。方法用肽指纹图谱验证重组agkihpin分子;以天然agkihpin、生理盐水(NS)或肝素为对照,分别用TAME水解、纤维蛋白平板、SDS-PAGE和纤维蛋白原凝集法检测r-agkihpin-1的精氨酸酯酶、纤溶活性、纤维蛋白原溶解和类凝血酶等生物学活性;以NS或粗毒为对照,用剪尾法和皮下注射法检测r-agkihpin-1的出血活性。结果 r-agkihpin-1中38.7%序列、8个肽段与Gen Bank中agkihpin氨基酸序列是一致的。r-agkihpin-1体外水解TAME的比活性为8.74 U/mg。4~16μg/mL剂量r-agkihpin-1可形成纤维蛋白溶圈面积0.50~1.10cm^2,NS组不形成溶圈,差异有统计学意义(P<0.01);16μg/mL剂量r-agkihpin-1可使90%α链和70%γ链分解,而NS组中纤维蛋白原不被消化,差异有统计学意义(P<0.01)。4~16μg/mL剂量r-agkihpin-1可形成凝块体积0.07~0.23 mm^3,高于NS组的0.01 mm^3,差异有统计学意义(P<0.05)。体内4~16 mg/kg体重剂量的r-agkihpin-1形成血栓干重28.01~22.46 mg/kg体重,低于NS组的35.92 mg/kg体重,差异有统计学意义(P<0.01)。上述活性均稍低于相同剂量的天然agkihpin,差异有统计学意义(P<0.05)。剪尾法、皮下注射法显示4~16 mg/kg、4~32 mg/kg体重剂量的r-agkihpin-1在小鼠中出血时间和出血活性分别为1.81~11.32 min和0.00~0.01,显著低于1 mg/kg体重剂量粗毒的30.00 min(P<0.01)和7.85(P<0.01)。结论 r-agkihpin-1就是agkihpin的重组蛋白,r-agkihpin-1将来有望成为一种新的抗血栓药物。