蕲蛇标准品DNA特异鉴定指纹片段的克隆及评价

目的以工程菌为载体,寻找可以长期保存中药材蕲蛇标准品特异DNA指纹区段的克隆技术.方法采用蕲蛇DNA检测试剂盒提取蕲蛇标准品基因组DNA,按照2010年版《中国药典》收录的方法进行蕲蛇特异DNA片段PCR扩增,将PCR产物与质粒载体重组后导入工程菌细胞内;体外培养细菌,提取重组质粒,应用PCR及测序方法鉴定插入片段是否正确.将鉴定正确、携带正品蕲蛇特异DNA序列的菌落置-80℃冰柜保存,分别以30 d、60 d、3个月和6个月为时间点进行复苏,进行稳定性评价.结果PCR扩增蕲蛇标准品特异DNA片段长度约为300 bp,插入质粒载体后,转入工程菌细胞内的蕲蛇DNA经体外克隆、PCR扩增及测序鉴定,扩增产物与目标大小一致,序列与Genbank中蕲蛇序均一致.将4个时间点复苏后的菌落进行PCR扩增后,条带清晰,没有降解.结论采用分子克隆技术保存蕲蛇特异基因片段的方法可行、有效,方法简单明了,获得的标准品DNA稳定性良好,结果可靠.