Purification and Characterization of Cytotoxins from Agkistrodon acutus Venom and Their Anticancer Activity

Aim To investigate the anticancer activity of two new cytotoxins from thevenom of Agkistrodon acutus. Methods The venom was isolated by FPLC column chromatography consistingof DEAE Sepharose FF and Source 30S. The cytotoxic activity on tumor cells was detected by MITmethod. Purity and molecular weight were determined by SDS-PAGE (silver staining). Their stabilitiesto temperature and pH were also detected. Results Two pure cytotoxins named ACTX-6 and ACTX-8 wereobtained. Their molecular weights are 98 kDa and 27 kDa, respectively. ACTX-6 consists of twosubunits bonded together by disulfide bonds. Conclusion ACTX-6 and ATCX-8 have highest inhibitoryactivity on lung cancer cell A549. ACTX-6 is stable to heat while ACTX-8 not. ACTX-6 is stablebetween pH 7-9 and ACTX-8 between pH 6 - 9.

乙醇对五步蛇(Agkistrodon acutus)毒毒性的影响

目的为了探索乙醇对五步蛇毒毒性的影响。方法将五步蛇毒不同浓度致死量经不同浓度乙醇体外处理后，选择小白鼠分别给予皮下注射、口服，并将致死量蛇毒于小白鼠皮下注射后立即于局部注射乙醇，观察蛇毒毒性情况。结果使用乙醇体外处理后的五步蛇毒毒性明显下降，小白鼠经皮下注射致死量五步蛇毒后立即在局部注射50％异蛇米酒或75％乙醇0．1～0．2ml有一定的保护作用，口服20倍致死量五步蛇毒未发现有毒性表现。结论五步蛇毒体外经过乙醇处理后毒性明显下降。口服五步蛇毒是安全的。蛇毒进入皮下后立即用乙醇处理有一定的治疗效果。

新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin止血作用的实验研究

目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果.方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果:静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血粘度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致.试验结果显示,Agacutin对部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性、血小板体外聚集、优球蛋白凝固时间均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性.腹腔注射Agacutin0.5～2 U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%).结论:Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白且不激活凝血因子Ⅱ和XIII,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成血栓形成.

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的 :从蝮亚科尖吻蝮蛇毒 (Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶 (Non- hem onrrhagicfibrinolytic enzym e,NHFL E)并对其理化性质进行研究。方法 :应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFL E,用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力 ,用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)测定其相对分子质量 ,用皮内出血实验测定其出血活性。结果 :从蝮亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶 ,它的相对分子质量为 2 5 0 0 0 ,没有出血活性 ,在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白 ,相对活性为粗毒的 3.2倍。结论 :从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为 2 5 0 0 0的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性 。

抗五步蛇毒ScFv噬菌体显示文库的构建及表达

目的 :构建抗五步蛇毒的特异性ScFv噬菌体显示文库 ,并从中筛选出阳性克隆。方法 :用五步蛇毒素免疫BALB C小鼠 ,挑选其中效价最高的 3只小鼠提取脾脏组织 ,抽提细胞总RNA ,经RT PCR分别扩增出VH、VL基因片段 ,经Linker连接成ScFv基因 (singlechainvariablefragment) ,再把ScFv基因重组到pCANTAB 5E载体 ,转化至大肠杆菌TG1中表达 ,经辅助噬菌体 (Helperphage)M13K0 7拯救后建成噬菌体显示文库。结果 :经 4轮吸附 洗脱 富集筛选后 ,库容量达到 4× 10 8cfu L ,随机挑取 90个克隆进行ELISA检测 ,结果 16个呈阳性 ,并进行了重复验证。结论

基因重组蛇毒纤溶因子rFII理化特性及纤溶能力的研究

【目的】研究重组蛇毒纤溶因子的理化特性和纤溶能力。【方法】SDS鄄PAGE及高效液相法分析重组蛇毒纤溶因子rFII相对分子质量、纯度,等电聚焦分析其等电点;纤维平板和SDS鄄PAGE检测重组蛇毒纤溶因子对纤维蛋白及纤维蛋白原的水解能力。【结果】重组蛇毒纤溶因子rFII是一个相对分子质量在28000,等电点9.0的碱性蛋白酶。它水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、酌亚基,水解能力随时间和浓度的增加而增加。它对纤维蛋白的水解能力比相同浓度下的纤溶酶强4倍。【结论】rFII是一种高效的水解纤维蛋白原和纤维蛋白的碱性蛋白酶。

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶对动物凝血功能的影响

目的 :探讨尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶 (Non- hem onrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFL E)对动物凝血功能的影响。方法 :用动物体内外实验方法观察 NHFL E对富血小板血浆中经 ADP诱导的血小板聚集的影响及 NHFL E对凝血功能的影响。结果 :NHFL E能明显延长全血凝固时间、活化的部分凝血酶原时间、凝血酶时间和凝血酶原时间 ,产生抗凝作用。动物体内注射 NHFL E后血浆纤维蛋白原含量降低 ,优球蛋白的溶解时间缩短。结论 :尖吻蝮蛇毒 NHFL E对动物的凝血功能有影响 。

一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶对血液活性的研究

目的研究蛇毒类凝血酶Agacutin的止血效果。方法新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果。结果静脉注射Agacutin0.01～0.05U·kg-1剂量后,各剂量组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30min药效达高峰,药效持续24h。与给药前比较,各实验组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致。试验结果显示,Agacutin对活化部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性。腹腔注射Agacutin0.5～2.0U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%)。结论Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白和不激活凝血因子Ⅱ和,当有伤口时,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成不溶性纤维蛋白和血栓的形成。所有实验结果显示,Agacutin是一个有效的潜在止血剂。

基因重组蛇毒纤溶因子rFII的酶学特性研究

目的研究重组蛇毒纤溶因子的酶学特性。方法通过SDS-PAGE分析其分子量、纯度,用SDS-PAGE方法检测其对纤维蛋白原的水解能力,用分光光度法检测其水解azocasein的能力和PMSF及EDTA对蛇毒纤溶因子的作用。结果蛇毒重组纤溶因子rFII是一个分子量在28000的蛋白酶。它呈时间和浓度依赖性水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、γ亚基,EDTA和PMSF均可以抑制该因子水解azocasein的能力。结论rFII是一种纤维蛋白原酶,它的酶活性可同时被EDTA和PMSF所抑制。

尖吻蝮蛇蛇毒中一种新型酸性磷酯酶的纯化和表征

从尖吻蝮蛇蛇毒中,通过嗜硫色谱、Sephadex G-75、Blue胶和POROS HQ20离子交换色谱,分离纯化得到纯组分AA-PLA2-I,并证明其为新型酸性磷酸酯酶A2.经鉴定,该酶为分子量14.4 kD的单体蛋白,等电点5.66,不含中性糖基,N端序列为SLIQFETLIMKVVKK,其磷酸酯酶A2活性的最适温度和pH条件分别为50℃和pH10.此外,该酶蛋白酶活性较弱,无出血毒性,但具有抗凝血活性,且其抗凝血活性耐热至70℃.

尖吻蝮蛇蛇毒对刚地弓形虫侵入宿主细胞的作用研究

目的 观察细胞培养系统中宿主细胞在不同剂量源自皖南地区的尖吻蝮蛇 (Agkistrodonacutus)蛇毒的作用下感染刚地弓形虫速殖子百分率的差异 ;探讨运用蝮蛇蛇毒作为辅助因子提高细胞培养用于弓形虫病病原学诊断的敏感性。方法 以尖吻蝮蛇蛇毒加入分孔培养的Hela细胞和THP - 1细胞中 ,分别用IFA和流式细胞仪进行检测 ,观察尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的影响。结果 在相同的时间内 ,在尖吻蝮蛇蛇毒的作用下 ,Hela细胞和THP - 1细胞感染弓形虫速殖子的百分率在不同的时段均明显的提高。结论 尖吻蝮蛇蛇毒可以促进弓形虫速殖子侵入宿主细胞 ,在实际应中 ,可以作为一种辅助因子在检测标本时提高速殖子检出率 。

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

目的测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列,酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法通过生物化学方法获得高纯化Agacutin,经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品,后者通过Edman降解法,测定了亚基N端15个氨基酸残基序列。结果大亚基(16kDa)的序列为:DCSSGWSSYEEHQYY,小亚基(15kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV。结论测序结果经NCBI数据库检索发现,Agacutin为新的蛇毒类凝血酶。

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤溶酶对大鼠的长期毒性试验

目的:研究无出血活性纤溶酶(Non-hemorrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)对大鼠的长期毒性,评价其安全性。方法:健康Wistar大鼠随机分为低、中、高剂量(2.25,4.5,9.0 mg·kg^(-1)·d^(-1))组及生理氯化钠注射液对照组,每组24只。尾静脉注射给药,每周给药7 d,连续给药4周,给药容积为10 mL·kg^(-1)。停药后24 h每组处死12只动物,余下动物继续观察2周后活杀检查。观察动物一般性状、体重、饮食等,检测血液学、凝血、血液生化、脏器系数及组织病理学改变。结果:NHFLE高剂量组大鼠在4周给药期出现多动、烦躁不安、轻微腹泻以及体重增长缓慢,以上改变在停药后恢复正常,其余动物各项检查未见异常。结论:NHFLE毒性较低。

皖南尖吻蝮蛇毒出血毒素Ⅳ的纯化与初步鉴定

从皖南尖吻蝮蛇（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎａｃｕｔｕｓ）毒液中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００两步凝胶柱层析首次纯化出一种中分子量出血毒素（简称ＡａＨⅣ）．经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和等电聚焦凝胶电泳测定其分子量为４４ｋＤ，等电点为ｐＨ５．０．从５００ｍｇ粗毒中可获得２０ｍｇＡａＨⅣ纯品．ＡａＨⅣ有较强的出血活性，最小出血剂量（ＭＨＤ）为０．４μｇ．

蕲蛇酶对动物实验性血栓的防栓和溶栓作用

采用大鼠颈动脉－颈外静脉回路循环形成的血小板性动脉血栓，用兔脑粉浸出液诱导的大鼠下腔静脉血栓以及用凝血酶诱导的兔耳缘静脉血栓，作为实验性动脉及静脉血栓模型，并分别用阿斯匹林和尿激酶作为阳性对照药，以观察蕲蛇酶对血栓形成的影响。不同剂量的蕲蛇酶（６００，３００和１５０μｇ／ｋｇｉｖ）能使大鼠动脉和静脉血栓形成减少，并呈量效关系。蕲蛇酶对家兔耳缘静脉血栓形成亦表现抑制作用并促进血栓消褪。３００和６００μｇ／ｋｇ对家兔已形成的动脉和静脉血栓，能促使消褪。

蕲蛇酶抗栓作用机理的初步分析

动物实验结果示，蕲蛇酶能裂解纤维蛋白原成为可溶性纤维蛋白，降低血中纤维蛋白原浓度，抑制血小板聚集，对抗由凝血酶诱导的血浆凝块聚集的血浆凝块回缩，因而发挥预防血栓形成作用。对纤维蛋白平板试验无直接溶纤作用，但能增加实验动物血中ｔ－ＰＡ活性。

蕲蛇酶对大白鼠和家兔实验性脑血栓的溶栓作用

采用血小板聚集诱导剂二磷酸腺苷（ＡＤＰ）加肾上腺素（Ａｄ）从家兔颈内动脉或大白鼠颈总动脉注入，以形成脑血栓，２ｈ后各组动物分别从静脉给予不同剂量蕲蛇酶（１５０、３００和６００ｍｇ／ｋｇ），阳性对照药潘生丁（１０ｍｇ／ｋｇ）及空白对照生理盐水（１ｍｌ／ｋｇ）。以脑组织对伊文思蓝通透性改变及脑组织切片计算血栓数目为指标，判断蕲蛇酶对血栓的影响。结果不同剂量蕲蛇酶组对大鼠或家兔的实验性脑血栓均比生理盐水组血栓消褪加快，形成的血栓数目减少，脑组织伊文思蓝含量亦明显减少；

蕲蛇酶在健康志愿者的Ⅰ期临床研究

健康志愿者１８人，男１１人，女７人，除该药研制者２人年龄为６５和６６岁外，其余平均年龄为２６±ｓ６．２岁。分３组，分别一次静脉滴注蕲蛇酶注射液１Ｕ（１５０μｇ）、２Ｕ（３００μｇ）、３Ｕ（４５０μｇ）。３种剂量均能使血小板明显抑制，血小板明显减少，部分凝血活酶时间明显延长，纤维蛋白原明显下降，血浆ＦＤＰ含量明显增多，优球蛋白溶解时间（ＥＬＴ）明显缩短，优球蛋白复钙时间明显延长，并大多呈量效关系。对凝血酶原时间无明显变化。３种剂量对血浆ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆固醇及胆红素等的影响均在正常波动范围内，此说明对肝功能无损害作用。其中对胆固醇则反有降低效果。对尿素氮和肌酐的影响亦均在正常波动范围内。对血糖亦无明显影响。对白细胞和血红蛋白等血像的影响亦在正常波动范围内。上述结果说明蕲蛇酶在高达３Ｕ（４５０μｇ）剂量下，对肝、肾、血像无明显不良反应。呼吸、血压、脉搏及体温均无明显变化。大剂量组有２例在血压计袖套压迫处出现数个散在性瘀血点，２４ｈ后自然消失。小剂量组１例（原为过敏体质）用药后出现喉头水肿过敏反应。

抗蝮蛇毒血清与抗五步蛇毒血清在竹叶青蛇咬伤治疗中的应用研究

目的探讨抗蝮蛇毒血清与抗五步蛇毒血清在竹叶青蛇咬伤治疗中的应用效果。方法选取2020年1-12月我院急诊科收治的80例竹叶青蛇咬伤患者为研究对象,采用随机数字表法分为对照组(n=40)和观察组(n=40)。对照组给予抗蝮蛇毒血清治疗,观察组给予抗五步蛇毒血清治疗,观察比较两组治疗后的凝血功能指标水平[包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时(APTT)、纤维蛋白原含量(FIB)、凝血酶凝固时间(TT)]、凝血功能恢复时间、住院时间、治疗费用、需追加抗蛇毒血清量及输血量。结果治疗前,两组患者的PT、APTT、FIB、TT比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);治疗后,观察组患者的PT、APTT、FIB、TT水平均显著改善,与对照组比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)。观察组患者的凝血功能指标恢复时间为(2.67±1.33)d、平均住院时间为(3.15±0.93)d,对照组的凝血功能恢复时间(5.18±2.72)d、平均住院时间(5.67±2.34)d,两组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。两组患者的治疗费用、需追加抗蛇毒血清量、输血量比较,观察组明显少于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论抗五步蛇毒血清治疗竹叶青蛇咬伤能有效促进凝血功能恢复,提高治疗效果,降低治疗费用,值得临床应用。

尖吻蝮蛇AaHⅣ催化结构域和非催化结构域免疫保护性比较

目的表达尖吻蝮蛇出血性P-Ⅲb型金属蛋白酶AaHⅣ催化结构域和非催化结构域,并鉴定其免疫小鼠后抗体的中和保护性。方法采用基因合成的方法合成尖吻蝮蛇P-Ⅲ6型金属蛋白酶AaHⅣ的催化结构域和非催化结构域cDNA,分别重组在质粒pET28a(+)上,转入BL21(DE3)中表达,产物经亲和层析纯化。昆明小鼠随机分为催化结构域蛋白免疫组、非催化结构域蛋白免疫组、AaHⅣ免疫组、PBS免疫组,每组6只[4周龄,体质量(20±2)g,雌雄各半],3次免疫后分离血清,与AaHⅣ体外孵育后行出血中和实验。结果 ELISA显示重组表达的AaHⅣ催化结构域和非催化结构域均具有免疫原性。出血中和实验显示:催化结构域免疫组和非催化结构域免疫组均较PBS免疫组显著减少出血面积(P<0.05);AaHⅣ免疫组与催化结构域免疫组之间无统计学差异(P>0.05),而与非催化结构域免疫组之间存在统计学差异(P<0.05)。结论 AaHⅣ催化结构域免疫小鼠产生的抗体在中和AaHⅣ出血毒性方面效果更为显著。