尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样酶的分离、纯化及其生化药理研究

本文报道自尖吻蝮蛇中分离、纯化三个凝血酶样酶(Thrombin-like Enzymes,TLEs),TLE-A,TLE-Ⅵ及TLE-Ⅶ。双向免疫扩散分别出现单一沉淀线,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分别呈单一区带,并依此测定分子量分别为66、31及14KD。试管内TLES能使纤维蛋白原或血浆形成纤维强白微凝块。凝血酶样酶制剂(TLES)150μg/ml效价与牛凝血酶1.0U/ml接近。肝素不能对抗其凝血效应,以对甲苯磺酰精氨酸甲基酯(TAME)为底物,其精氨酸酯酰活力可达2000μmol/min·mg左右。动物在体实验中,犬(n=6)静脉注射100μg/kg后4h药效达高蜂,血浆纤维蛋白原含量明显降低(P<0.02),凝血酶时间明显延长,血浆副凝血试验强阳性,血小板聚集功能明显抑制,家兔(n=10)每日静脉注射300μg/kg连用7天,对血液凝固系统效应与犬相似。药后第8天处死家兔病理解剖无明显变化。小鼠一次静脉注射的LD_(50)及其95％可信限为14.5±2.2(12.3～16.6)mg/kg。

尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化

用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱技术,从尖吻蝮蛇毒中纯化得到一个具有凝血活性的组分。经Superdex75HR10/30预装柱检测,纯度达99.91%。SDS-PAGE显示为单一条带,还原、非还原条件下分子量分别为59.25k、52.58k。该组分的凝血酶比活为41.5u/mg,精氨酸酯酶比活为14.29u/mg,但不激活血浆凝血因子ⅩⅢ。EDTA不能抑制其凝血活性,而苯甲磺酰氟则产生不可逆抑制作用。结果表明该酶是一种新尖吻蝮蛇毒类凝血酶。

新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin止血作用的实验研究

目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果.方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果:静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血粘度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致.试验结果显示,Agacutin对部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性、血小板体外聚集、优球蛋白凝固时间均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性.腹腔注射Agacutin0.5～2 U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%).结论:Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白且不激活凝血因子Ⅱ和XIII,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成血栓形成.

五步蛇蛇毒类凝血酶N端的部分氨基酸序列

从五步蛇蛇毒中纯化得到的类凝血酶 ,在SDS PAGE及IEF均为一条带 ,且分子质量约 38ku ,等电点约为 4 0。测定该酶N端 1 5个氨基酸的序列是VIGGVECDINEHRFL 。

尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶在兔体内的药物动力学

本文采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测(ELISA)技术,研究家兔一次快速iv 75,150及300μg/kg的凝血酶样酶(thrombin—like enzymes,TLEs)后24 h内血浆药物代谢动力学。结果表明,TLEs在家兔的血浆浓度时间过程以三室模型模拟较为合适,三种剂量的各参数的均数之间经F检验除中央室表观分布容积外无显著差别。其t_(1/2α)为3.86～5.12min,t_(1/2β)为43.3～59.8min,t_(1/2γ)为17.6～19.5h。

^(131)I标记尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶在动物体内的分布

用氯胺T法对尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的抗血栓组分凝血酶样酶进行^(131)Ⅰ标记,观察其在大、小鼠体内的分布。以实验组和给予同剂量凝血酶样酶混合Na^(131)Ⅰ的对照组的放射性参入量(脏器与血液放射比)的比值作为凝血酶样酶在组织中分布的依据。结果表明,一次快速ⅳ凝血酶样酶后2h分布最多的为肾、其次为肺、脾、肾上腺和肝。给药后4h,肾、脾、肺和肝比2h时高,心脏含量较少,其它组织未见有分布。尿中含量高,表明其主要经肾脏随尿排泄;经胆汁排出则很少。

一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶对血液活性的研究

目的研究蛇毒类凝血酶Agacutin的止血效果。方法新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果。结果静脉注射Agacutin0.01～0.05U·kg-1剂量后,各剂量组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30min药效达高峰,药效持续24h。与给药前比较,各实验组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致。试验结果显示,Agacutin对活化部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性。腹腔注射Agacutin0.5～2.0U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%)。结论Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白和不激活凝血因子Ⅱ和,当有伤口时,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成不溶性纤维蛋白和血栓的形成。所有实验结果显示,Agacutin是一个有效的潜在止血剂。

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

目的测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列,酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法通过生物化学方法获得高纯化Agacutin,经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品,后者通过Edman降解法,测定了亚基N端15个氨基酸残基序列。结果大亚基(16kDa)的序列为:DCSSGWSSYEEHQYY,小亚基(15kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV。结论测序结果经NCBI数据库检索发现,Agacutin为新的蛇毒类凝血酶。

三步柱色谱法从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶

建立了一种用CM Sepharo se CL-6B阳离子交换、DEAE Sepharo se Fast F low阴离子交换和Sephadex G-75凝胶排阻三步柱色谱从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法。在实验室小柱分离方案的基础上,对该纯化工艺进行了放大。当上样量达实验室小柱的25倍时,所得类凝血酶的质量指标与实验室小柱基本一致。采用该法所得的蝮蛇类凝血酶经Sh im-pack D io l-300高效凝胶排阻柱测得其相对分子质量约为33 500,用Sh im-pack VP-OD S反相色谱柱检测其纯度约为96%。从江浙粗蛇毒中提取类凝血酶时,类凝血酶的总质量收率约为0.3%,总活性收率约为64%,比活可达2 000U/m g。

蕲蛇酶对动物实验性血栓的防栓和溶栓作用

采用大鼠颈动脉－颈外静脉回路循环形成的血小板性动脉血栓，用兔脑粉浸出液诱导的大鼠下腔静脉血栓以及用凝血酶诱导的兔耳缘静脉血栓，作为实验性动脉及静脉血栓模型，并分别用阿斯匹林和尿激酶作为阳性对照药，以观察蕲蛇酶对血栓形成的影响。不同剂量的蕲蛇酶（６００，３００和１５０μｇ／ｋｇｉｖ）能使大鼠动脉和静脉血栓形成减少，并呈量效关系。蕲蛇酶对家兔耳缘静脉血栓形成亦表现抑制作用并促进血栓消褪。３００和６００μｇ／ｋｇ对家兔已形成的动脉和静脉血栓，能促使消褪。

蕲蛇酶抗栓作用机理的初步分析

动物实验结果示，蕲蛇酶能裂解纤维蛋白原成为可溶性纤维蛋白，降低血中纤维蛋白原浓度，抑制血小板聚集，对抗由凝血酶诱导的血浆凝块聚集的血浆凝块回缩，因而发挥预防血栓形成作用。对纤维蛋白平板试验无直接溶纤作用，但能增加实验动物血中ｔ－ＰＡ活性。

蕲蛇酶对大白鼠和家兔实验性脑血栓的溶栓作用

采用血小板聚集诱导剂二磷酸腺苷（ＡＤＰ）加肾上腺素（Ａｄ）从家兔颈内动脉或大白鼠颈总动脉注入，以形成脑血栓，２ｈ后各组动物分别从静脉给予不同剂量蕲蛇酶（１５０、３００和６００ｍｇ／ｋｇ），阳性对照药潘生丁（１０ｍｇ／ｋｇ）及空白对照生理盐水（１ｍｌ／ｋｇ）。以脑组织对伊文思蓝通透性改变及脑组织切片计算血栓数目为指标，判断蕲蛇酶对血栓的影响。结果不同剂量蕲蛇酶组对大鼠或家兔的实验性脑血栓均比生理盐水组血栓消褪加快，形成的血栓数目减少，脑组织伊文思蓝含量亦明显减少；

蕲蛇酶在健康人的药物代谢动力学

健康自愿者１４人，男９人，女５人，除研究者本身（女，６４岁）外，平均年龄２５．８±ｓ６．５岁，分３组。分别一次ｉｖ蕲蛇酶注射液１Ｕ（１５０），２Ｕ（３００）和３Ｕ（４５０μｇ）。用ＥＬＩＳＡ方法检测药后不同时间血药浓度以研究药代动力学。结果显示血药－时间曲线符合二室开放模型，其ｔ１／２α分别为０．６６±０．１０，０．９７±０．３４和１．２２±０．７７ｈ，ｔ１／２β分别为１５．９５±２．４，１８．８０±４．９４和１９．７３±４．

液相色谱分离纯化五步蛇毒凝血酶样酶

目的:改进分离工艺,找到液相色谱分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的最佳方案。方法:五步蛇毒依次经Superdex G75凝胶过滤、DEAE-Sephrose F.F阴离子交换和Superdex G30凝胶过滤,通过改变洗脱液pH值、流速、Tris浓度、盐浓度及上样量来考察对分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的影响。结果:Superdex 75凝胶过滤色谱分离纯化受洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量的影响;DEAE-Sephrose F.F阴离子交换色谱受盐浓度的影响;Superdex G30凝胶过滤色谱受上样量的影响。三步分离纯化后获得一种五步蛇毒凝血酶样酶,分子量约23kD。结论:依次经Superdex G75、DEAE-Sephrose F.F和Superdex G30凝胶,通过改变洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量等能得到最佳分离条件,最终可获得五步蛇毒凝血酶样酶的纯品。

蕲蛇酶在健康志愿者的Ⅰ期临床研究

健康志愿者１８人，男１１人，女７人，除该药研制者２人年龄为６５和６６岁外，其余平均年龄为２６±ｓ６．２岁。分３组，分别一次静脉滴注蕲蛇酶注射液１Ｕ（１５０μｇ）、２Ｕ（３００μｇ）、３Ｕ（４５０μｇ）。３种剂量均能使血小板明显抑制，血小板明显减少，部分凝血活酶时间明显延长，纤维蛋白原明显下降，血浆ＦＤＰ含量明显增多，优球蛋白溶解时间（ＥＬＴ）明显缩短，优球蛋白复钙时间明显延长，并大多呈量效关系。对凝血酶原时间无明显变化。３种剂量对血浆ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆固醇及胆红素等的影响均在正常波动范围内，此说明对肝功能无损害作用。其中对胆固醇则反有降低效果。对尿素氮和肌酐的影响亦均在正常波动范围内。对血糖亦无明显影响。对白细胞和血红蛋白等血像的影响亦在正常波动范围内。上述结果说明蕲蛇酶在高达３Ｕ（４５０μｇ）剂量下，对肝、肾、血像无明显不良反应。呼吸、血压、脉搏及体温均无明显变化。大剂量组有２例在血压计袖套压迫处出现数个散在性瘀血点，２４ｈ后自然消失。小剂量组１例（原为过敏体质）用药后出现喉头水肿过敏反应。

蕲蛇酶在实验性动物的尿、粪排泄率和血浆蛋白结合率研究

用１３１Ｉ标记方法研究蕲蛇酶在大鼠尿、粪中排泄情况和与家兔血浆蛋白结合率，结果表明，其自大鼠尿中排泄率为结合量的３２．８±ｓ０．４８％，粪中排泄率为４．９６±ｓ０．９９％，与家兔血清蛋白结合率为３０．６３％。

应用生物技术分离纯化类凝血酶

福建蕲蛇粗毒经硫酸铵沉降处理后,进行DEAE-Sephadex A-50色谱分离,取其最高活性的第11峰进行G-75凝胶色谱分离后,经CM-Sephadex C-50离子交换色谱、HQ20离子交换色谱分离,获得一个有高凝血活性的组分,在SDS-PAGE电泳图谱上对应分子量为24100。与其他从蕲蛇中已分离的类凝血酶比较,该蛋白组分是一个新的类凝血酶。

五步蛇蛇毒类凝血酶的分离和纯化

用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析，从五步蛇粗毒中分离纯化出一种促凝组分（类凝血酶），并对其纯度和促凝活性作鉴定。

浙江尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯化及促凝活性

采用柱色谱等纯化方法从浙江尖吻蝮蛇凝血酶中提取获得一种类凝血酶(TQ-1),采用RP-HPLC、MALDI-TOF、SDS-PAGE、等电聚焦电泳、Edman降解法对其进行了结构确证,并对其体内、外凝血活性进行测定。纯化所得TQ-1纯度98.5%,相对分子质量为30 522.95,SDS-PAGE分析其为一种单链蛋白,等电点为4.5,N末端氨基酸序列为VIGGN-ECDTNEHRFL。体外凝血活性为900 U/mg,小鼠体内凝血试验结果表明:TQ-1凝血活性与阳性对照药巴曲亭相似。TQ-1为一种未见报道的尖吻蝮蛇类凝血酶,具有较高的开发价值。

狗注入尖吻蝮类凝血酶后纤维蛋白(元)降解产物对血凝的影响

目的：观察狗注入尖吻蝮蛇毒类血酶（ＡＡＶ－ＴＬＥ）后，血清纤维蛋白（元）降解产物对血液凝固的影响。方法：将ＡＡＶ－ＴＬＥ静脉注入狗体内，分别测定凝血活酶时间（ＫＰＴＴ）、凝血酶元时间（ＰＴ）以及血浆纤维蛋白原（Ｆｇｎ）和血清纤维蛋白（元）降解产物（ＦＤＰ）含量。结果：ＫＰＴＴ和ＰＴ明显延长；血清ＦＤＰ显著增加；血浆Ｆｇｎ含量大幅度下降。结论：狗注入ＡＡＶ－ＴＬＥ后，ＫＰＴＴ和ＰＴ延长除与血浆Ｆｇｎ下降有关外，ＦＤＰ的增加是主要原因。