江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒神经生长因子的分离纯化和特性

神经生长因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗ ｔｈ ｆａｃｔｏｒ， Ｎ Ｇ Ｆ）是第一个被发现，也是迄今为止研究得最为清楚的一种神经营养因子 利用 Ｐ Ｃ１２ 细胞生物活力测定为跟踪检测手段，分别经过 Ｃ Ｍ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ Ｌ６ Ｂ、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 及 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ ｍ ｏｎｏ Ｓ层析，从３０ ｇ 江浙蝮蛇粗毒中分离纯化到２００ μｇ Ｎ Ｇ Ｆ，纯化倍数高达１０５经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 测定，该蛋白分子量为 ２６ ｋ Ｄ，由两个亚基通过二硫键交联组成二体形式等电聚焦显示其等电点为６７，与氨基酸组成分析结果相吻合 江浙蝮蛇神经生长因子的生物活力水平与小鼠２５ Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ相当，在１～１００ μｇ／ Ｌ 的浓度范围内维持 Ｐ Ｃ１２

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒的抑菌作用及其抑菌组分L-氨基酸氧化酶的分离纯化

我们用平皿测活法研究了江浙蝮蛇毒对真菌和大肠杆菌生长的抑制作用,并对其抗细菌的组分进行柱层析分离纯化,得到组分单一的LAO:不仅有抑菌作用还有L-氨基酸氧化酶的活性。纯化后LAO的比活力为808U/mg。蛇毒经酸性聚丙烯酰胺电泳后测抑菌活性发现有3个抑菌组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),LAO为抑菌组分Ⅱ。

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒抗凝血活酶组份抗凝机理的研究

应用三次离子交换柱层析和一次凝胶过滤从浙江产蝮蛇毒中分离纯化了抗凝血活酶组份。测定出该组份由119个氨基酸残基组成,分子量为15,000道尔顿,等电点为9.4,N—末端为组氨酸。纯化的抗凝血活酶组份在体外对血浆重钙化时间有显著影响,但不延长血浆凝血酶原时间和凝血酶时间,对纤维蛋白也无溶解作用,极低浓度(0.5微克/毫升)的抗凝组份就能抑制血液凝血活酶的生成。家兔静脉注射抗凝血活酶组份后十分钟,全血凝固时间和血浆重钙化时间均明显延长,但血浆凝血酶原时间、纤维蛋白含量和全血凝块溶解时间却不受影响。蝮蛇毒抗凝血活酶组份具有磷脂酶A_(2)活性,但血浆中磷脂的水解似乎并不是血浆凝固延迟的主要原因,很可能是抗凝血活酶组份能够同血浆中凝血活酶组份(磷脂部份)可逆地结合,从而干扰了凝血酶原的活化。

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒蛋白水解酶的分离纯化及其理化性质研究

应用DEAE-Sephadex A-50,Sephadex G-75,Sephadex G-200和QAE-SephadexA-25柱层析,从浙江蝮蛇毒中分离纯化出一种具有酪蛋白水解活性的蛋白水解酶a,称之为蛋白酶a.纯化后的蛋白酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳鉴定,均呈现一条区带。等电点为6.4.用凝胶过滤及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其分子量为68000,糖蛋白染色法表明蛋白酶a是一糖蛋白。紫外吸收光谱表明蛋白酶a在277nm波长处有最大吸收,消光系数E_(277nm)^(0.1%)=0.681.蛋白酶a含有丰富的天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。

浙江产蝮蛇Agkistrodon halys(Pallas)蛇毒磷酸二酯酶的酶学性质及其对大分子核酸的作用

1.以双对硝基苯磷酸钠为底物,测得蝮蛇毒磷酸二酯酶的最适pH在10左右,最适温度在60℃左右;酶在37℃和60℃的Km分别为5.65×10^(-4)M和7.97×10^(-4)M。2.酶在pH5—10.5范围和50℃以下稳定。3.钙离子和镁离子对酶活力有激活作用,但钡离子、镁离子、锌离子、二价铅离子、钴离子、二价和三价铁离子、锰离子、镍离子等都有不同程度地抑制作用。4.除乙酸根离子外,碳酸根,硫酸根,乙二胺四乙酸根、磷酸根,钼酸根,酒石酸根,柠檬酸根,亚硝酸根,巴比妥酸根和硫代硫酸根等阴离子都有不同程度地抑制作用。5.蝮蛇毒磷酸二酯酶能充分水解RNA和DNA但后者的水解速度比前者快许多。

蝮蛇特异性抗体的制备及其效价测定

目的制备蝮蛇特异性抗体,为进一步研发抗蛇毒血清提供理论依据。方法以蝮蛇蛇毒蛋白作为抗原,通过免疫新西兰兔制备蝮蛇特异性抗体,应用间接ELISA法检测其效价,Western blot检测其特异性。结果成功制备了蝮蛇特异性抗体血清,其效价可达1∶100000,Western blot检测抗体对蝮蛇蛇毒具有专一性。结论本研究成功制备了蝮蛇特异性抗体,推进了抗蝮蛇毒血清的研发。

浙江蝮蛇毒诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的体外实验研究

目的 :研究浙江蝮蛇毒诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的作用及机理。方法 :采用MTT法测定IC50 值及生长曲线 ,流式细胞仪 (FCM )AnnexinⅤFITC/PI法检测细胞凋亡发生率 ,PI染色法检测细胞周期 ,同时用流式细胞汁FCM及Western blot检测Bcl 2蛋白表达。结果 :浙江蝮蛇毒能抑制Jurkat细胞生长 ,且呈剂量依赖关系 ,并能诱导人白血病Jurkat细胞凋亡 ,4 8h时作用最强 ,此时Bcl 2蛋白表达下降 ,随后此作用减弱 ,低浓度作用下细胞逐渐恢复生长。结论 :浙江蝮蛇毒能诱导人白血病Jurkat细胞凋亡 ,且呈剂量依赖关系 ,此作用与Bcl

蝮蛇毒血小板抑制因子对动脉血栓形成的影响及机制研究

目的:探讨皖南蝮蛇毒血小板抑制因子(AHV-PI)对家兔动脉血栓形成的影响及可能机制。方法:新西兰家兔24只,随机分成假手术组、动脉血栓模型组、阳性对照组(奥扎格雷钠,5mg/kg),AHV-PI(0.1mg/kg)实验组共4组,每组6只。应用70%FeCl3溶液化学损伤的方法来制备家兔颈动脉血栓模型,采用血栓弹力仪(TEG)描计血栓弹力图,比浊法测定家兔血小板聚集率,ELISA测定各组血浆中α颗粒膜蛋白(GMP-140)和血栓素B2(TXB2)水平,光镜和透射电镜分别观察动脉血栓形成和血小板形态的改变。结果:AHV-PI实验组与模型组相比,血栓弹力图凝血时间(R)值和血凝块形成时间(K)值延长(P<0.01和P<0.05),Alpha角度、最大幅度(MA)和凝血指数(CI)减小(P<0.05和P<0.01);血小板聚集率的各项指标均明显降低(P<0.05);血浆中GMP-140和TXB2含量降低(P<0.01)。AHV-PI实验组光镜下动脉内未见血栓形成,血小板电镜显示血小板形态基本规则,与模型组相比伪足较少,α-颗粒和致密颗粒无明显减少,胞浆空泡化现象减轻。结论:AHV-PI可以通过抑制血小板聚集,防止动脉血栓的形成,其机制可能与之保护血小板超微结构,减少血小板脂质代谢和颗粒内容物的释放有关。

用尖吻蝮蛇毒、蝗蛇毒及抗蛇毒血清处理小鼠S_(180)、EAC腹水癌的初步观察

本文报道了尖吻蝮蛇毒、蝮蛇毒及抗蛇毒血清能使接种S_(180)、EAC腹水癌的小鼠明显延长存活时间、降低接种率,但不能完全阻止痛细胞生长。体外具有较明显的导致,菡细胞肿胀、膜破裂,核纤维化,坏死等。从腹水酶活力测定及抗血清初步研究结果表明,癌细胞病变中产生的某些抗原物质可能与蛇毒中的酶和毒蛋白相近。因此注射蛇毒后可在体内产生相关抗体,中和癌细胞产生的毒素以达到治疗目的。

江浙蝮蛇毒镇痛组分对吗啡依赖大鼠尾状核神经肽的调控作用

目的:研究江浙蝮蛇毒镇痛C4组分对大鼠尾状核中神经肽水平的调控作用。方法:应用微透析技术,探针定位于大鼠尾状体,以人工脑脊液透析,HPLC检测亮氨酸脑啡肽、β-内啡肽和P物质的含量,动态监测其变化。结果:在吗啡依赖大鼠给予C4组分后,尾状核亮氨酸脑啡肽含量显著增高,为可乐定组的1.5倍,并持续作用8h以上,而β-内啡肽和P物质含量变化较小。结论:C4组分主要作用于亮氨酸脑啡肽,通过提高其含量发挥镇痛作用。

蛇毒PCA改善冠脉微血栓大鼠血液流变学的机制研究

目的:探讨皖南产蝮蛇毒(AHV)蛋白C激活物(PCA)改善冠脉微血栓(CAM)大鼠血液流变学的作用机制。方法:Sprague-Dawley大鼠50只,随机分为假手术组、CAM组、低、中、高剂量PCA[CAM+PCA(0.5mg/kg)、CAM+PCA(2 mg/kg)、CAM+PCA(8 mg/kg)]干预组,每组10只。通过从主动脉根部直接向左心室注入月桂酸钠1.0 mg/kg(浓度10 g/L)以建立大鼠冠脉微血栓模型,采用血栓弹力仪系统(TEG)描计血栓弹力图,测定各组血浆中内皮素-1(ET-1)、P-选择素(P-selectin)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平;Western blotting检测心肌组织中P-selectin和肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白表达;光镜观察心肌组织学改变。结果:与模型组比较,PCA大剂量干预组凝血时间和血凝块形成时间延长,Alpha角度、最大幅度和血凝指数值减小(P<0.05),血浆CK-MB、LDH、AST、ET-1和P-selectin的水平降低(P<0.05),心肌组织P-selectin和TNF-α的蛋白表达下降(P<0.05)。病理观察显示中、高剂量PCA干预组大鼠冠脉未形成微血栓。结论:蝮蛇毒PCA组分可以限制冠脉微血栓的形成,降低血浆ET-1和P-selectin的含量,抑制心肌组织P-selectin和TNF-α表达,改善微血栓后血液流变学变化,有效保护心肌细胞。

江浙蝮蛇神经生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化

将江浙蝮蛇（ＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｈａｌｙｓＰａｌａｓ，Ａ．ｈ．Ｐ．）神经生长因子（Ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）基因克隆于分泌型原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ＋，以Ｃ端融合了６个组氨酸的形式在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行了ＩＰＴＧ诱导表达。ＳＤＳＰＡＧＥ分析确定有一比理论值略大的诱导表达条带，其表达量占全菌蛋白质的２０％左右，且表达蛋白质主要是以包涵体的形式存在。用６ｍｏｌ／Ｌ的盐酸胍溶解包涵体后，利用固定化金属离子（Ｎｉ２＋）配体亲和层析一步纯化目的蛋白质，纯度可达８０％左右。对该重组肽进行变复性研究。利用ＰＣ１２细胞进行生物活力测定，证明表达产物具有ＮＧＦ生物活力。

蝮蛇毒蛋白C激活物改善急性心肌梗死大鼠心功能的机制研究

目的:探讨皖南产蝮蛇毒(AHV)蛋白C激活物(protein C activator,PCA)改善急性心肌梗死大鼠心功能作用与机制。方法:Sprague-Daw-ly大鼠60只,随机分为假手术(SH)组、心肌梗死模型(MI)组、PCA低、中、高剂量组(0.5、2、8mg/kg)、阳性对照组(阿司匹林5mg/kg),每组10只。通过结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死(AMI)模型,采用Medlab生物信号处理系统监测大鼠心脏血流动力学变化。Westernblot检测心肌基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达;光镜观察心肌组织学改变。结果:与心肌梗死组比较,PCA高、中剂量大鼠左室内压最低值(LVDP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室压力最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室压力最大下降速率(-dp/dtmax)明显升高(P<0.05),MMP-9的蛋白表达下降(P<0.05)。病理观察显示PCA干预组较梗死模型组炎症细胞浸润显著减轻,梗死面积缩小。结论:蝮蛇毒PCA组分可以限制急性心肌梗死早期心肌梗死扩大,有效改善心脏血液动力学,抑制MMP-9表达,对急性心肌梗死后心室重构有一定的干预作用。

神经生长因子在康复医学中的应用(Ⅰ)——白眉蝮蛇乌苏里亚种蛇毒神经生长因子的分离纯化与鉴定

本研究结果表明:白眉蝮蛇乌苏里亚种蛇毒中含有神经生长因子(NGF),分离纯化该种NGF是可行的。经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析,NGF呈一条区带。它在20ng/ml浓度下,可刺激大鼠胚脑组织的生长。用电泳法测得NGF的分子量为45000。

717解毒合剂对蝮蛇毒所致局部组织损伤的保护作用与机制研究

目的研究717解毒合剂对蝮蛇咬伤动物模型局部组织损伤的保护作用及其可能的机制.方法将59只健康SD大鼠按随机数字表法分为生理盐水(NS)对照组(n=12)、蝮蛇毒模型组(n=9)、抗蝮蛇毒血清组(n=11)和717解毒合剂25、60、150 mg/kg组(均n=9).采用皮下注射50 g/L蛇毒溶液建立蝮蛇毒模型,NS对照组予以等量NS.制模成功后2 h,抗蝮蛇毒血清组于尾静脉注射抗蝮蛇毒血清(每只0.6 mL),717解毒合剂组分别予以25、60、150 mg/kg 717解毒合剂生药灌胃(每日1次,连用6 d),NS对照组和蝮蛇毒模型组予以等量NS灌胃,6 d后取各组大鼠血清及大腿腓肠肌.另取15只健康KM小鼠随机分为NS对照组、蝮蛇毒模型组和717解毒合剂10 mg/kg组,每组5只,制模方法同SD大鼠,制模后717解毒合剂组以10 mg/kg 717解毒合剂生药灌胃(每日1次,连用3 d),3 d后处死.观察各组大鼠局部组织损伤情况以及小鼠腹部皮下出血情况,光镜下观察各组大鼠腓肠肌的病理学改变,采用放射免疫法(RIA)测定血清细胞外基质透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)及层黏连蛋白(LN)水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核转录因子-κB(NF-κB)和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测各组腓肠肌诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达情况.结果蝮蛇毒制模后大鼠创面均出现典型中毒现象,且随时间延长逐渐加重,72 h后717解毒合剂60 mg/kg组大鼠的局部肿胀程度明显轻于同期蝮蛇毒模型组.制模4 h后KM小鼠腹部皮下可见弥漫性出血,为典型局部中毒,72 h后717解毒合剂10 mg/kg组小鼠的恢复情况明显优于同期蝮蛇毒模型组.蝮蛇毒模型组大鼠血清HA、ColⅣ和LN水平均明显高于NS对照组,而抗蝮蛇毒血清组及717解毒合剂60 mg/kg和150 mg/kg组上述指标水平则较蝮蛇毒模型组明显改善,其中HA和ColⅣ水平以717解毒合剂150 mg/kg组改善最为明显〔HA(μg/L):112.83±19.89比162.52±16.29,ColⅣ(μg/L):120.04±21.44比158.77±36.64,均P<0.01〕,LN水平以60 mg/kg组改善最为明显(μg/L:69.09±15.22比96.66±15.72,P<0.01).蝮蛇毒模型组大鼠血清IL-2、TNF-α、NF-κB和TGF-β1水平均明显高于NS对照组,而抗蝮蛇毒血清组及717解毒合剂60 mg/kg和150 mg/kg组上述指标水平则较蝮蛇毒模型组明显改善,其中NF-κB水平以717解毒合剂60 mg/kg组改善最为明显(ng/L:14.46±4.42比20.81±2.59,P<0.01).苏木素-伊红(HE)染色结果显示,NS对照组大鼠腓肠肌结构正常;蝮蛇毒模型组大鼠腓肠肌严重弥漫性肌纤维损伤与炎性浸润,可见大量细胞坏死;抗蝮蛇毒血清组大鼠腓肠肌损伤减轻,但炎性浸润显著;717解毒合剂组大鼠炎性细胞浸润减轻,正常细胞数增多.蝮蛇毒模型组大鼠腓肠肌iNOS和COX-2蛋白表达均较NS对照组明显增强,717解毒合剂60 mg/kg和150 mg/kg组的iNOS表达较蝮蛇毒模型组明显减弱,抗蝮蛇毒血清组及717解毒合剂各剂量组COX-2表达均较蝮蛇毒模型组明显减弱,其中以717解毒合剂150 mg/kg组变化最明显(iNOS/β-tubulin:0.71±0.13比0.95±0.14,COX-2/β-tubulin:0.33±0.10比0.67±0.11,均P<0.01).结论717解毒合剂能显著改善小鼠腹部皮下出血症状,促进新生肉芽组织生长,加快创面愈合,减轻腓肠肌病理损害,同时能明显改善大鼠局部组织结构,降低血清中细胞外基质成分含量与炎性因子水平,抑制腓肠肌iNOS和COX-2蛋白表达.

白眉蛇毒血凝酶治疗上消化道出血的系统评价

目的：评价白眉蛇毒血凝酶治疗上消化道出血的效果和安全性。方法：通过计算机检索中国知网、万方数据知识服务平台、中国生物医学文献服务系统、Pub Med、Ovid SP等收集有关白眉蛇毒血凝酶治疗上消化道出血的随机对照试验。由两名评价员独立对纳入文献进行资料提取、质量评价并交叉核对,而后采用Rev Man 5.2软件进行Meta分析。结果：共纳入文献12篇,共1272例患者。白眉蛇毒血凝酶组患者24、48、72 h内止血率均高于对照组,差异均具有统计学意义（P〈0.05）,无效率低于对照组,差异也具有统计学意义[风险比（RR）=0.28,95%可信区间（95%CI）=0.20-0.38,P〈0.01],不良反应发生率与对照组比较差异无统计学意义[风险差（RD）=0.00,95%CI=-0.02-0.03,P=0.67]。结论：白眉蛇毒血凝酶治疗上消化道出血是安全、有效的,但由于纳入研究的方法质量较低,可能存在发表性偏倚,期待更多高质量的随机双盲对照试验提供高质量的证据。

皖南蝮蛇蛇毒抗凝组份抗白血病作用的实验研究

目的:探讨皖南蝮蛇蛇毒抗凝组份对白血病细胞HL60和K562增殖的抑制作用。方法:采用细胞形态学观察,台盼蓝染色,MTT比色法测定蛇毒抗凝组份Ⅱ和Ⅲ(ACFⅡ和Ⅲ)对体外培养的白血病细胞株HL60和K562增殖的抑制作用。结果:蛇毒ACFⅢ对白血病细胞HL60和K562均有较强的抑制作用,蛇毒ACFⅡ对白血病细胞HL60和K562的影响经统计学分析无明显统计学意义。蛇毒ACFⅢ对HL60和K562的抑制作用呈剂量时间依赖性。结论:蛇毒ACFⅢ对白血病细胞系HL60和K562细胞的增殖有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用。

三步柱色谱法从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶

建立了一种用CM Sepharo se CL-6B阳离子交换、DEAE Sepharo se Fast F low阴离子交换和Sephadex G-75凝胶排阻三步柱色谱从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法。在实验室小柱分离方案的基础上,对该纯化工艺进行了放大。当上样量达实验室小柱的25倍时,所得类凝血酶的质量指标与实验室小柱基本一致。采用该法所得的蝮蛇类凝血酶经Sh im-pack D io l-300高效凝胶排阻柱测得其相对分子质量约为33 500,用Sh im-pack VP-OD S反相色谱柱检测其纯度约为96%。从江浙粗蛇毒中提取类凝血酶时,类凝血酶的总质量收率约为0.3%,总活性收率约为64%,比活可达2 000U/m g。

江浙蝮蛇毒C_4组分的分离纯化及药理性质研究

目的:分离筛选江浙蝮蛇毒的C4组分,研究其毒性、机体耐受性和依赖性等药理学性质。方法:采用离子交换和分子筛,以柱层析法分离蛇毒C4组分,并用急性毒性实验和自然戒断实验、耐受性实验考察其毒性、依赖性和耐受性。结果:经分离筛选后得到C4组分,并获得蛇毒C4组分的毒性作用、机体耐受性和依赖性等性质。结论:C4组分作为江浙蝮毒中的一个有效组分,在一定剂量范围内安全性良好,未发现耐受性和依赖性,值得进一步开发利用。

蝮蛇毒PCA抗血栓形成的实验研究

目的:探讨皖南产蝮蛇毒(AHV)蛋白质C激活物(Protein C Activator,PCA)组分抗血栓效应。方法:家兔40只,随机分为4组,每组10只,颈总动脉取l ml注入血栓形成仪4个(硅化)聚乙烯管中,各管中分别含50、30、10μl(0.6216 mg/ml)蝮蛇毒PCA组分及50μl生理盐水,37℃条件下以16 r/min在恒流泵上旋转制备血栓;SD大鼠60只,随机分为假手术(SH)组、心肌梗死模型(MI)组(月桂酸钠左心室注入造模)、PCA干预组(MI+PCA组分为0.5 mg/kg、2 mg/kg、8 mg/kg 3个剂量组)、阳性对照组(阿司匹林5mg/kg),每组10只,各实验组动物均于术后3 h颈总动脉取血,按同样方法制备血栓;血液离心,分离血浆检测凝血功能。结果:蝮蛇毒PCA组分大、中、小3剂量组与对照组相比较,血栓的干、湿重量及长度均比对照组减轻(P<0.05);MI+PCA组(2 mg/kg、8 mg/kg)与MI组比较,血栓的干、湿重量长度均有明显差异(P<0.05),与阳性对照组无差异(P>0.05);MI+PCA组(2 mg/kg、8 mg/kg)与MI组比较,PT、APTT均明显增高(P<0.05),FIB显著降低(P<0.05),TT差异无统计学意义(P>0.05)。结论:AHV粗毒中分离纯化的PCA组分可明显干预血栓的形成,其可能通过PCA激活蛋白质C(Protein C)改变凝血功能。