乙醇对五步蛇(Agkistrodon acutus)毒毒性的影响

目的为了探索乙醇对五步蛇毒毒性的影响。方法将五步蛇毒不同浓度致死量经不同浓度乙醇体外处理后，选择小白鼠分别给予皮下注射、口服，并将致死量蛇毒于小白鼠皮下注射后立即于局部注射乙醇，观察蛇毒毒性情况。结果使用乙醇体外处理后的五步蛇毒毒性明显下降，小白鼠经皮下注射致死量五步蛇毒后立即在局部注射50％异蛇米酒或75％乙醇0．1～0．2ml有一定的保护作用，口服20倍致死量五步蛇毒未发现有毒性表现。结论五步蛇毒体外经过乙醇处理后毒性明显下降。口服五步蛇毒是安全的。蛇毒进入皮下后立即用乙醇处理有一定的治疗效果。

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒的抑菌作用及其抑菌组分L-氨基酸氧化酶的分离纯化

我们用平皿测活法研究了江浙蝮蛇毒对真菌和大肠杆菌生长的抑制作用,并对其抗细菌的组分进行柱层析分离纯化,得到组分单一的LAO:不仅有抑菌作用还有L-氨基酸氧化酶的活性。纯化后LAO的比活力为808U/mg。蛇毒经酸性聚丙烯酰胺电泳后测抑菌活性发现有3个抑菌组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),LAO为抑菌组分Ⅱ。

新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin止血作用的实验研究

目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果.方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果:静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血粘度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致.试验结果显示,Agacutin对部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性、血小板体外聚集、优球蛋白凝固时间均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性.腹腔注射Agacutin0.5～2 U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%).结论:Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白且不激活凝血因子Ⅱ和XIII,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成血栓形成.

蝮蛇毒介导的心肌损伤与TNF-α表达的相关性

目的观察蝮蛇毒介导的心肌损伤与TNF-α的表达，探讨蝮蛇毒介导的心肌损伤的机制。方法96只小鼠随机分成12组（n=8），共设3个组：生理盐水（对照组）、蝮蛇毒＋生理盐水（实验组）、蝮蛇毒＋TNF-α抑制剂（干预组）；分4个时相点：1h、12h、24h和48h。ELISA检测血清cTnT水平，观察心肌组织病变，免疫组化检测心肌组织TNF-α蛋白的表达。对心肌病变积分、血清cTnT水平与心肌TNF-α表达行直线相关分析。结果实验组各时相点心肌病变积分和心肌TNF-α蛋白表达均高于干预组和对照组（P〈0．05），干预组各时相点均高对照组（P〈0．05），实验组和干预组48h〉24h〉12h〉1h（P〈0．05）；除1h组外，实验组各时相点血清cTnT水平均高于干预组及对照组（P〈0．05），干预组各时相点高于对照组（P〈0．05），实验组和干预组48h〉24h〉12h〉lh（P〈0．05）；小鼠心肌病变积分与心肌TNF-α表达呈显著正相关（r=0．728，P〈0．05），小鼠血清cTnT水平与心肌TNF-α表达呈显著正相关（，=0．666．P〈0．05）。结论蝮蛇毒可致小鼠急性心肌损伤，随时间的延长，心肌损伤越严重。TNF-α抑制剂能降低蝮蛇毒介导的心肌损伤程度、血清cTnT水平及心肌TNF-α蛋白的表达。TNF-α的过度表达可能是蝮蛇毒介导心肌损伤的机制之一。

五步蛇蛇毒纤溶组分Ⅱ的分离和若干药效学的特征

五步蛇蛇毒经DEAE—sephadex A—50柱层析.获得15个蛋白组分。sephadex G—50柱再层析组分Ⅱ,呈单一个蛋白峰,聚丙酰胺凝胶电泳结果呈单一区带。狗血浆纤维蛋白平板法证实五步蛇蛇毒组分Ⅱ有溶解纤维蛋白的作用,同时狗血浆纤维蛋白热平板法还证实其溶解纤维蛋白的作用系直接性的。体外试管实验显示组分Ⅱ虽对纤维蛋白和纤维蛋白原均有溶解作用.但在浓度17.8mg·L^(-1)以下时.其溶解纤维蛋白活性相对较高。兔scO.1ml(500mg·L^(-1)组分Ⅱ未发现类似五步蛇全毒的出血反应。小白鼠腹腔注射纯化后的组分Ⅱ,LD_(50)为11.105 mg,kg^(-1).

尖吻蝮蛇类凝血酶基因的克隆及生物信息学分析

为了获得蛇毒类凝血酶基因,本研究根据不同蛇毒类凝血酶cDNA5'和3'保守性序列设计了引物;通过RT-PCR从尖吻蝮蛇毒腺总RNA中扩增到1个808bp特异性片段,将该cDNA重组到pMD18-T载体中,利用生物信息学的方法对测序结果进行了分析。结果表明:该特异性片段中有一个783bp的开放阅读框架,其编码蛋白质序列与蛇的类凝血酶序列有98.5%的同源性,也具有蛇毒类凝血酶的典型特征。结论:本实验获得了一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶基因。

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的 :从蝮亚科尖吻蝮蛇毒 (Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶 (Non- hem onrrhagicfibrinolytic enzym e,NHFL E)并对其理化性质进行研究。方法 :应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFL E,用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力 ,用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)测定其相对分子质量 ,用皮内出血实验测定其出血活性。结果 :从蝮亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶 ,它的相对分子质量为 2 5 0 0 0 ,没有出血活性 ,在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白 ,相对活性为粗毒的 3.2倍。结论 :从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为 2 5 0 0 0的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性 。

一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶对血液活性的研究

目的研究蛇毒类凝血酶Agacutin的止血效果。方法新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果。结果静脉注射Agacutin0.01～0.05U·kg-1剂量后,各剂量组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30min药效达高峰,药效持续24h。与给药前比较,各实验组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致。试验结果显示,Agacutin对活化部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性。腹腔注射Agacutin0.5～2.0U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%)。结论Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白和不激活凝血因子Ⅱ和,当有伤口时,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成不溶性纤维蛋白和血栓的形成。所有实验结果显示,Agacutin是一个有效的潜在止血剂。

尖吻蝮蛇蛇毒中一种新型酸性磷酯酶的纯化和表征

从尖吻蝮蛇蛇毒中,通过嗜硫色谱、Sephadex G-75、Blue胶和POROS HQ20离子交换色谱,分离纯化得到纯组分AA-PLA2-I,并证明其为新型酸性磷酸酯酶A2.经鉴定,该酶为分子量14.4 kD的单体蛋白,等电点5.66,不含中性糖基,N端序列为SLIQFETLIMKVVKK,其磷酸酯酶A2活性的最适温度和pH条件分别为50℃和pH10.此外,该酶蛋白酶活性较弱,无出血毒性,但具有抗凝血活性,且其抗凝血活性耐热至70℃.

尖吻蝮蛇蛇毒对刚地弓形虫侵入宿主细胞的作用研究

目的 观察细胞培养系统中宿主细胞在不同剂量源自皖南地区的尖吻蝮蛇 (Agkistrodonacutus)蛇毒的作用下感染刚地弓形虫速殖子百分率的差异 ;探讨运用蝮蛇蛇毒作为辅助因子提高细胞培养用于弓形虫病病原学诊断的敏感性。方法 以尖吻蝮蛇蛇毒加入分孔培养的Hela细胞和THP - 1细胞中 ,分别用IFA和流式细胞仪进行检测 ,观察尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的影响。结果 在相同的时间内 ,在尖吻蝮蛇蛇毒的作用下 ,Hela细胞和THP - 1细胞感染弓形虫速殖子的百分率在不同的时段均明显的提高。结论 尖吻蝮蛇蛇毒可以促进弓形虫速殖子侵入宿主细胞 ,在实际应中 ,可以作为一种辅助因子在检测标本时提高速殖子检出率 。

基因重组蛇毒纤溶因子rFII理化特性及纤溶能力的研究

【目的】研究重组蛇毒纤溶因子的理化特性和纤溶能力。【方法】SDS鄄PAGE及高效液相法分析重组蛇毒纤溶因子rFII相对分子质量、纯度,等电聚焦分析其等电点;纤维平板和SDS鄄PAGE检测重组蛇毒纤溶因子对纤维蛋白及纤维蛋白原的水解能力。【结果】重组蛇毒纤溶因子rFII是一个相对分子质量在28000,等电点9.0的碱性蛋白酶。它水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、酌亚基,水解能力随时间和浓度的增加而增加。它对纤维蛋白的水解能力比相同浓度下的纤溶酶强4倍。【结论】rFII是一种高效的水解纤维蛋白原和纤维蛋白的碱性蛋白酶。

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

目的测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列,酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法通过生物化学方法获得高纯化Agacutin,经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品,后者通过Edman降解法,测定了亚基N端15个氨基酸残基序列。结果大亚基(16kDa)的序列为:DCSSGWSSYEEHQYY,小亚基(15kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV。结论测序结果经NCBI数据库检索发现,Agacutin为新的蛇毒类凝血酶。

神经生长因子在康复医学中的应用(Ⅰ)——白眉蝮蛇乌苏里亚种蛇毒神经生长因子的分离纯化与鉴定

本研究结果表明:白眉蝮蛇乌苏里亚种蛇毒中含有神经生长因子(NGF),分离纯化该种NGF是可行的。经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析,NGF呈一条区带。它在20ng/ml浓度下,可刺激大鼠胚脑组织的生长。用电泳法测得NGF的分子量为45000。

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶对动物凝血功能的影响

目的 :探讨尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶 (Non- hem onrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFL E)对动物凝血功能的影响。方法 :用动物体内外实验方法观察 NHFL E对富血小板血浆中经 ADP诱导的血小板聚集的影响及 NHFL E对凝血功能的影响。结果 :NHFL E能明显延长全血凝固时间、活化的部分凝血酶原时间、凝血酶时间和凝血酶原时间 ,产生抗凝作用。动物体内注射 NHFL E后血浆纤维蛋白原含量降低 ,优球蛋白的溶解时间缩短。结论 :尖吻蝮蛇毒 NHFL E对动物的凝血功能有影响 。

浙江蝮蛇毒诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的体外实验研究

目的 :研究浙江蝮蛇毒诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的作用及机理。方法 :采用MTT法测定IC50 值及生长曲线 ,流式细胞仪 (FCM )AnnexinⅤFITC/PI法检测细胞凋亡发生率 ,PI染色法检测细胞周期 ,同时用流式细胞汁FCM及Western blot检测Bcl 2蛋白表达。结果 :浙江蝮蛇毒能抑制Jurkat细胞生长 ,且呈剂量依赖关系 ,并能诱导人白血病Jurkat细胞凋亡 ,4 8h时作用最强 ,此时Bcl 2蛋白表达下降 ,随后此作用减弱 ,低浓度作用下细胞逐渐恢复生长。结论 :浙江蝮蛇毒能诱导人白血病Jurkat细胞凋亡 ,且呈剂量依赖关系 ,此作用与Bcl

蝮蛇毒神经毒素的分离

目的 :从蛇毒中提取出神经毒素。方法 :采用DEAE -sephadexA5 0柱及sephadexG - 5 0柱层析出神经毒素 ,并通过生理记录仪等方法鉴定。结果 :不仅有效地分离出神经毒素 ,而且保留了其较好的生物活性。结论

基因重组蛇毒纤溶因子rFII的酶学特性研究

目的研究重组蛇毒纤溶因子的酶学特性。方法通过SDS-PAGE分析其分子量、纯度,用SDS-PAGE方法检测其对纤维蛋白原的水解能力,用分光光度法检测其水解azocasein的能力和PMSF及EDTA对蛇毒纤溶因子的作用。结果蛇毒重组纤溶因子rFII是一个分子量在28000的蛋白酶。它呈时间和浓度依赖性水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、γ亚基,EDTA和PMSF均可以抑制该因子水解azocasein的能力。结论rFII是一种纤维蛋白原酶,它的酶活性可同时被EDTA和PMSF所抑制。

蝮蛇毒蛋白C激活物的纯化与抗血小板活性

目的 研究蝮蛇毒蛋白C激活物 (PCA)组分对兔血小板聚集性的影响。方法 借助DEAE Cellulose、SP SephadexC 5 0及SP SephadexG 75柱层析 ,以离子交换和凝胶过滤法从江浙蝮蛇 (AHV)粗毒中分离纯化PCA抗凝组分 ;SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)检测其纯度和分子量。比浊法测定血小板聚集率。结果 从AHV分离纯化的PCA抗凝组分经SDS PAGE电泳测定为单一区带 ,相对分子质量为 14 0 0 0左右 ,等电点 pH 4 .7;该PCA在体外对由诱聚剂ADP诱导的血小板聚集呈剂量依赖性的抑制作用 ,其IC50 为 12 5 μg/ml。PCA(1.0mg/kg) 体内给药可逆性抑制血小板聚集反应。结论 从蝮蛇毒中纯化的这种PCA抗凝组分可通过抑制血小板聚集而影响血凝过程。

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤溶酶对大鼠的长期毒性试验

目的:研究无出血活性纤溶酶(Non-hemorrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)对大鼠的长期毒性,评价其安全性。方法:健康Wistar大鼠随机分为低、中、高剂量(2.25,4.5,9.0 mg·kg^(-1)·d^(-1))组及生理氯化钠注射液对照组,每组24只。尾静脉注射给药,每周给药7 d,连续给药4周,给药容积为10 mL·kg^(-1)。停药后24 h每组处死12只动物,余下动物继续观察2周后活杀检查。观察动物一般性状、体重、饮食等,检测血液学、凝血、血液生化、脏器系数及组织病理学改变。结果:NHFLE高剂量组大鼠在4周给药期出现多动、烦躁不安、轻微腹泻以及体重增长缓慢,以上改变在停药后恢复正常,其余动物各项检查未见异常。结论:NHFLE毒性较低。

蝮蛇毒诱导小鼠心肌损伤与血清NT-proBNP表达的相关性

目的观察蝮蛇毒诱导的小鼠心肌损伤与血清NT-proBNP表达情况,以探讨蝮蛇毒诱导心肌损伤的机制。方法 96只小鼠随机分成蝮蛇毒组和正常组,蝮蛇毒组1.50 mg/kg蝮蛇毒肌注,正常组生理盐水肌注。肌注后1 h、12 h、24 h、48 h时酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清肌钙蛋白(cTnT)和N末端B型尿钠肽原(NT-proBNP)水平,并观察心肌组织病变。对心肌病变积分、血清cTnT水平与血清NT-proBNP水平行直线相关分析。结果蝮蛇毒组各时相点心肌病变积分和血清NT-proBNP表达水平高于正常组(P<0.05),且随时间延长而增高(P<0.05);除1 h组外,蝮蛇毒组各时相点血清cTnT水平均高于正常组(P<0.05),且随时间延长而增高(P<0.05)。小鼠心肌病变积分与血清NT-proBNP水平呈显著正相关(r=0.647,P<0.05),血清cTnT水平与NT-proBNP水平呈显著正相关(r=0.529,P<0.05)。结论蝮蛇毒可致小鼠急性心肌损伤,随时间的延长心肌损伤加重,NT-proBNP水平增高。NT-proBNP的合成与释放增加可能是蝮蛇毒诱导心肌损伤的机制之一。