植物毛状根研究与应用进展

植物毛状根是一种特殊表现形式的不定根,由发根农杆菌感染植物外植体创面后诱导转化而产生,因其具有生长速度快、培养便捷、遗传性质稳定、次生代谢物合成能力强等优势而受到关注。植物毛状根诱导培养技术被广泛运用于遗传转化、植株再生、次生代谢产物生产、环境修复等领域。影响植物毛状根诱导及转化效率的因素众多,例如植物种类、外植体类型、发根农杆菌菌株等。同时,在研究应用中存在一些问题,如不同种类植物的毛状根诱导方案难以直接参考使用,规模化、产业化生产水平较低等。对植物毛状根的特性、诱导原理、影响因素、应用现状等进行归纳,可为未来植物毛状根的研究和应用提供参考。

何首乌毛状根的诱导及其培养

利用发根农杆菌LBA940 2和R16 0 1诱导药用植物何首乌产生毛状根。由PCR扩增和Southern杂交证实 ,由LBA940 2诱导的毛状根整合了Ri质粒的TL DNA片段 ;冠瘿碱的高压纸电泳证实 ,由两种菌诱导的毛状根整合了Ri质粒的TR DNA片段。毛状根经抗生素和温度除菌后 ,表现出粗壮、绒毛密集、分枝多 ,且在无激素的培养基上能够快速稳定繁殖的特性。经筛选得到何首乌毛状根优良离体培养系PC9e和PC1e。

发根农杆菌K599对大豆、黄瓜和凤仙花活体感染生根的研究

利用野生型的发根农杆菌K599对属于不同科属的大豆、黄瓜和凤仙花进行活体感染实验,结果表明,发根农杆菌K599可使切割后的大豆、黄瓜和凤仙花子叶形成不定根,生根频率分别为100%、65%和91%。此外,发根农杆菌K599还可以使未进行创伤切割的黄瓜腋芽处形成不定根,生根频率为10%。根据发根农杆菌所具有的rolC基因序列,设计PCR引物,对再生的毛状根DNA进行PCR扩增,验证了再生的毛状根中含有发根农杆菌T-DNA序列。文章中获得的转基因根为进一步开展大豆、黄瓜的根结线虫病理以及凤仙花的矮化育种研究提供了前提材料。

发根农杆菌诱导桑树毛状根体系的建立

应用发根农杆菌ACCC10060,以直接接种和共培养2种方法侵染桑树10 d龄子叶,并将2种处理的外植体分别接种于MS+AS(乙酰丁香酮,100μmol/L)的平板,暗培养2 d后转接至MS+CS(头孢霉素,200 mg/L)平板培养3周,每3 d转接1次以除去其中所含的发根农杆菌菌体,结果2种侵染方法均成功诱导桑树产生毛状根,诱导效率分别为14%和17%。在无激素MS培养基上离体培养除菌后的毛状根,呈现旺盛的生长态势和典型的发状根结构特点。CTAB法提取毛状根基因组并进行PCR检测,结果扩增出了423 bp的rolB基因片段,表明Ri质粒的T-DNA已经成功整合到桑树的基因组中。

发根农杆菌诱导黄芩毛状根的研究

利用发根农杆菌A4,A4 9615,1.2556诱导中药黄芩外植体,得到黄芩不定根,根据形态和在MS培养基中进行培养证实得到黄芩毛状根,经抗菌素氨苄西林钠500 mg/L除菌后,毛状根表现出分枝多,生长快,且能在MS中生长繁殖的特性,为采用生物技术生产黄芩活性成分奠定基础。

发根农杆菌诱导花生发根的条件优化

以花生无菌苗的不同部位为外植体,用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogene)GIM1.141进行侵染,诱导发根,以为花生的转基因研究和花生发根提取白藜芦醇奠定基础。通过对重悬菌液乙酰丁香酮的添加、不同外植体、菌液浸泡时间以及发根培养基4种因素的研究,优化发根农杆菌的转化体系。结果表明,花生的叶片、子叶、下胚轴均能被GIM1.141诱导出发根,相同诱导条件下,各外植体的发根诱导率顺序为叶片>子叶>下胚轴;适宜的菌液浸泡时间为10min;附加乙酰丁香酮(100μmol/L),发根诱导率明显提高,花生叶片、子叶、下胚轴的最高发根诱导率分别为87.29%、75.8%、23.33%,因此,花生发根诱导的合适条件为以叶片和子叶为外植体,在添加乙酰丁香酮(100μmol/L)的菌液中浸泡10min诱导出来的发根经过除菌,能在MSB5培养基上自主生长。

不同理化因子对黄芩毛状根诱导的影响

目的:利用发根农杆菌1.2556诱导黄芩,得到毛状根。方法:采用共培养法诱导黄芩毛状根,研究不同外植体,不同预培养时间,不同菌液浓度,不同感染时间,乙酰丁香酮,抗生素浓度等条件对转化率的影响。结果:利用预培养2d后的茎段为转化材料,当发根农杆菌浓度在OD600值为0.5时感染10min,转化率最高。在菌液中或培养基中添加100μmol/L乙酰丁香酮可以提高黄芩毛状根的转化效率。培养基中加入250mg/L抗生素Cef能较好地抑制发根农杆菌生长。结论:用共培养法诱导出黄芩毛状根,并确定了最佳诱导条件,以提高黄芩外植体的诱导率。

地黄毛状根的诱导及条件优化

以发根农杆菌Accc10060菌株侵染地黄外植体,研究不同菌液浓度、不同侵染时间和不同共培养时间对地黄毛状根诱导率的影响。结果表明,发根农杆菌Accc10060菌株可成功诱导出地黄毛状根,PCR检测发现发根农杆菌Ri质粒rol C基因已整合到地黄基因组中并得到表达;单因素试验结果显示,在地黄毛状根的诱导过程中,诱导的最佳菌液浓度为OD600=0.6,最佳侵染时间为10 min,最佳共培养时间为4 d。

发根农杆菌菌株和花生品种对发根诱导率的影响

试验以花育20、花育45、鲁花11无菌花生子叶为材料,采用3×3双因子设计,研究3株发根农杆菌菌株和花生品种对花生发根诱导率的影响。结果表明:发根农杆菌和花生品种均显著影响发根诱导率。花育45的发根诱导率最高,为93.7%,其适宜菌株为A4;花育20的发根诱导率为89.2%,适宜菌株为ATCC15834;鲁花11的发根诱导率为73.4%,适宜菌株为GIM1.141。

发根农杆菌诱导毛酸浆毛状根条件的优化

以4种发根农杆菌A4、C58C1、R1601、ATCC15834为诱导菌株侵染毛酸浆叶片、茎段,研究了发根农杆菌种类、外植体类型、不同预培养时间、不同侵染时间、不同共培养时间和乙酰丁香酮对毛酸浆毛状根诱导率的影响,并用PCR检测rolB基因。结果表明:4种发根农杆菌均能诱导毛酸浆外植体产生毛状根,ATCC15834的诱导率相对较高,叶片优于茎段;最佳侵染时间为6~8min;预培养和共培养时间均为2~3d时诱导率较高;乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol·L^(-1)有利于促进毛状根的产生,经PCR检测证明,rolB基因已整合到毛酸浆毛状根基因组中。

乌拉尔甘草毛状根的诱导及离体培养

为获得甘草的药用成分和保护甘草野生资源,利用发根农杆菌ATCC15834、A4侵染乌拉尔甘草幼苗、子叶、下胚轴,获得毛状根,建立了乌拉尔甘草毛状根培养系统,经PCR和毛细管凝胶电泳检测,在248 bp有rolA基因,在490 bp有rolC基因,证实发根农杆菌基因片段在甘草毛状根的基因组中整合并得到表达,其中无菌实生苗毛状根诱导率达79.5%,毛状根分枝较多,生长速度快,在不添加激素的1/2MS液体培养基中生长明显,培养25天后,鲜重平均增殖达19.13倍,乌拉尔甘草毛状根培养体系的建立为进一步利用生物反应器规模化培养甘草药用活性成分提供了参考。

不同发根农杆菌诱导花生发根研究

利用5种发根农杆菌侵染不同花生外植体,对比其发根诱导率,分析寻找利于花生转化的外植体、花生品种及发根农杆菌。结果表明,农杆菌94022诱导发根率较其它发根农杆菌高;后期继代培养中子叶诱导的发根易于培养,存活率高,生长状态好;在用培养后的子叶为外植体时,花育20较其它品种发根诱导率高。

瞿麦毛状根的高效诱导及培养

为大量生产瞿麦毛状根及后续研究提供依据,通过发根农杆菌A4菌株和R1601菌株侵染瞿麦(Dianthus superbus L.)叶片诱导毛状根,探讨菌株类型、侵染时间和培养基类型对瞿麦毛状根诱导率的影响。结果表明:A4菌株和R1601菌株均可诱导瞿麦叶片产生毛状根,A4和R1601菌株分别侵染瞿麦叶片5 min和10 min的毛状根诱导率最高,分别达81.2%和78.60%。毛状根在1/2MS液体培养基中扩繁效果最好。经分子鉴定,瞿麦毛状根由发根农杆菌侵染产生。

银柴胡离体培养与毛状根诱导技术初步研究

以银柴胡茎段为外植体,经消毒获得无菌再生材料后,筛选发根农杆菌介导毛状根诱导产生的最适条件。结果显示:最适的无菌消毒方法为:70%酒精浸5 s,0.1%升汞消毒3 min,获得了银柴胡离体培养材料;以发根农杆菌A4菌株介导的银柴胡毛状根诱导过程中,与叶片和不带腋芽茎段相比,带腋芽茎段为最适转化外植体,用OD600=0.8的菌液侵染茎段15 min,共培养3 d,800 mg/L头孢噻肟钠除菌,其诱导率及诱导密度最高,分别为100%和4.7,为最适诱导条件。研究结果说明在适合条件下,银柴胡带腋芽茎段适于诱导毛状根。

金银花发根诱导初探

研究了发根农杆菌的菌株类型、菌种浓度、浸染时间、预培养和共培养时间等对金银花发根诱导的影响。结果表明:农杆菌R1000培养OD600至0．6左右,稀释40倍浸染4 min时,诱导率最高,诱导率达58％。金银花外植体预培养5 d,与农杆菌共培养3 d,然后转入含500 mg／L羧苄青霉素的培养基杀菌培养是最适合的。

龙胆毛状根的诱导培养

发根农杆菌（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｓ）Ｒ１５００感染龙胆茎段、叶片外植体，１５ｄ后可诱导出毛状根。茎段诱导率高于叶片，可达４２．３％。毛状根的诱导与温度和光照有关。转化根具有抗卡那霉素的特征，在不含激素的ＭＳ培养基上培养，筛选出了生长正常的毛状根系。

苦参毛状根诱导及其培养条件的研究

[目的]为药用成分苦参碱及氧化苦参碱的来源提供新途径。[方法]考察了R1601菌株对苦参不同外植体在不同浓度乙酰丁香酮和侵染时间影响下苦参毛状根的诱导率;研究了培养基中的组分和浓度对苦参毛状根继代生长的影响。[结果]以苦参幼芽为外植体,在R1601菌液中添加100μmol/L乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃,MS共培养基上暗培养2 d,苦参毛状根的诱导效果较好,诱导率28.6%,存活率46.7%;苦参毛状根在改良的继代培养基上生长良好。[结论]苦参毛状根的最佳诱导条件:以生长1周的苦参幼芽为外植体,R1601为菌株,添加100μmol/L的乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃暗处诱导。

用农杆菌Ri诱导金银花发根培养的研究

通过预培养时间、菌液稀释倍数、浸染时间、共培养时间、抗生素质量浓度5因素4水平的正交实验,得出优化组合,认为组培苗叶片外植体预培养5 d,菌液稀释45倍,浸染4 min,共培养3 d,然后转入含500 mg/L羧苄青霉素的1/2M S培养基上培养,金银花的发根诱导率最高,达54.3%.随机抽取离体培养的发根经PCR检测,证实为转化发状根.

不同培养条件对牛膝发根诱导的研究

目的:利用发根农杆菌A4,R1,1601,1025诱导牛膝,得到发根。方法:采用共培养法诱导牛膝发根,研究不同菌种类型、不同外植体、不同浸染时间、乙酰丁香酮浓度等条件对转化率的影响。结果:利用发根农杆菌1025浸染牛膝的叶片为转化材料,当感染8min,转化率最高。在培养基中添加50μmol.L-1乙酰丁香酮可以提高牛膝发根的转化效率。结论:用共培养法诱导出牛膝发根,并确定了最佳诱导条件,以提高牛膝外植体的诱导率。

乌克兰龙葵毛状根诱导条件优化

[目的]利用3种发根农杆菌A4、C58C1、A1476诱导乌克兰龙葵产生毛状根,探究乌克兰龙葵毛状根诱导的最佳条件。[方法]利用植物组织培养技术,研究不同外植体、菌株、侵染时间、预培养天数、菌液浓度和共培养天数等对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响。[结果]叶片为最佳外植体材料;3种菌株均能诱导出毛状根,但A4诱导率最高;最佳菌液浓度为OD600=0.6;最佳侵染时间为5 min;预培养和共培养均为2 d时诱导率最高。[结论]乌克兰龙葵毛状根诱导条件的优化,为其他植物毛状根诱导提供参考,同时为进一步利用植物毛状根生产药用成分提供试验基础。