Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of CryⅠA(b) gene to Trichoderma harzianum

In this study, CryⅠA(b) gene was successfully transferred into the biocontrol fungus Trichoderma har- zianum with an efficiency of 60—180 transformants per 106 spores by using Agrobacterium tumefaciens-mediated trans- formation. Putative transformants were analyzed to test the presence of CryⅠA(b) gene by Southern blot. Most trans- formants contained a single T-DNA copy. RT-PCR analysis showed that the CryⅠA(b) gene was transcribed. Antifungal activities and insecticidal activities of the transformants were examined. There was no obvious difference in antifungal activities between the transformants and their wild strains. The modified mortalities of the transformants T1 and T2 were 69.57% and 91.30%, respectively. The tranformation system mediated by A. tumefaciens proved to be a powerful tool for the filamentous fungi transformation and functional genomic study with its high transformation frequency, sim- plicity of T-DNA integration, and genetic stability of transformants.

农杆菌介导的哈茨木霉T-DNA转化系统优化及拮抗能力突变子的性质分析

采用单因子试验方法研究了农杆菌EHA105介导的哈茨木霉Th-33转化过程中,各主要因素对转化效率的影响,建立了高效的转化系统,使农杆菌转化哈茨木霉的效率达到60～150个转化子/10^6个木霉孢子,利用该转化系统构建了含有8000多个转化子的T-DNA插入突变库。通过转化子与立枯丝核菌的对峙试验,从1260株转化子中筛选到23株拮抗能力发生变化的突变子。随机挑选5株突变子对其遗传稳定性进行分析,表明5株突变子都具有稳定性,聚合酶链式反应（PCR）表明上述突变子均有T-DNA片段的插入。

影响根癌农杆菌介导的木霉菌遗传转化因素分析

采用根癌农杆菌介导的转化方法,以木霉菌分生孢子为受体材料,对影响转化效率的主要因素进行了分析。结果表明,农杆菌菌株类型、初始菌液量、分生孢子浓度、共培养时间以及乙酰丁香酮的诱导等因素对转化效率都具有重要的影响。通过对这些因素的分析,基本得出了根癌农杆菌转化系统对木霉菌遗传转化的特点和规律,为将该转化系统用于其它丝状真菌的遗传转化提供了重要参考。

根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究

利用根癌农杆菌EHA105进行了哈茨木霉Th-33的转化,在优化的转化条件下,EHA105对木霉菌的转化效率约45-100个转化子/106个孢子。利用该方法已建立了含4000多个转化子的木霉T-DNA插入突变体库。随机挑选24个转化子进行遗传稳定性分析,结果显示转化子经过5代无选择压力连续转接后都能在选择平板上正常生长;潮霉素抗性基因的PCR扩增和Southern blot分析表明,木霉转化子含有该基因,Southern blot进一步表明转化子多为单拷贝随机插入。该转化体系的改进将有利于木霉菌生防功能基因的克隆和作用机制的研究。

根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展

木霉作为土传植物病原菌的生防真菌,研究其功能基因具有重要的意义。根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具。对根癌农杆菌介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述。

根癌农杆菌介导的深绿木霉菌T23遗传转化研究

采用根癌农杆菌介导的方法,成功地建立了丝状生防真菌深绿木霉(Trichoderma atroviride)菌株T23的遗传转化体系。并且,通过提高筛选培养基中潮霉素B的浓度和调整农杆菌的培养时间,对转化体系作了进一步的优化。转化效率约为50个突变体/107个分生孢子。所有转化子经继代培养5代,潮霉素B抗性筛选后,共得到118个遗传稳定的转化子。随机抽取部分转化子,进行PCR和Southern blot分子鉴定,结果证实外源的T-DNA已经随机整合到T23的基因组中。通过形态学观察,筛选出3个在产孢量和菌丝体生长速度方面显著不同于野生型菌株T23的转化子。农杆菌介导的遗传转化方法在深绿木霉菌株T23上的成功运用,将为研究该菌的功能基因组提供强有力的工具。

根癌农杆菌介导的木霉插入转化及其应用

根癌农杆菌介导的遗传转化法(ATMT)已广泛地应用于真菌的转化研究,该方法具有操作简单、转化效率高和转化子遗传稳定等特点。木霉作为土传植物病原菌的重要生防真菌,对其生防分子作用机制方面的研究也越来越受到关注,目前所面临的问题是如何基因突变和基因替换。ATMT法为木霉(Trichodermaspp.)的分子生物学研究提供了一个强有力的工具,在木霉的插入突变、遗传转化以及基因标记和克隆方面起着重要的作用。本文综述了根癌农杆菌介导木霉遗传转化的原理、特点、转化方法和应用,并且对有关发展趋势进行了展望。

农杆菌介导转化木霉原生质体的研究

目的:利用里氏木霉原生质体作为受体材料研究根癌农杆菌介导转化的条件。方法:以潮霉素抗性基因为筛选条件,里氏木霉原生质体为转化受体,分别对不同的根癌农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、共培养时间、共培养温度和共培养基pH进行根癌农杆菌介导转化里氏木霉,研究上述条件下根癌农杆菌介导转化里氏木霉的转化效率。结果:在根癌农杆菌菌液OD660为0.8、乙酰丁香酮浓度为80μg/mL、共培养时间为48 h、共培养温度为24℃、共培养基pH为5.4时,根癌农杆菌介导转化里氏木霉原生质体的效率最高,在此条件下,根癌农杆菌介导转化的效率为87个转化子/106个细胞,是传统以分生孢子为受体材料的1.9倍。结论:建立了根癌农杆菌介导转化里氏木霉原生质体的方法,获得了适宜的转化条件,有利于对里氏木霉遗传改造时获得大量的转化子。

不同根癌农杆菌菌株类型对木霉菌遗传转化效率的影响

研究报道了不同根癌农杆菌菌株类型对木霉菌遗传转化效率的影响，结果表明，在所选用的3种根癌农杆菌中，AGL-1和GV3101介导的木霉菌转化获得成功，转化效率分别为60～180个转化子／10^7个孢子和40～120个转化子／10^7个孢子，而农杆菌LBA4404介导的转化没有获得成功。该研究为探讨根癌农杆菌介导的转化系统在其它丝状真菌遗传转化上的应用提供了参考。

农杆菌介导生防棘孢木霉菌转化体系的优化

目的:实现棘孢木霉菌T4的遗传转化并优化其转化体系。方法:以潮霉素抗性为选择标记,利用农杆菌转化法介导转化棘孢木霉菌。结果:潮霉素基因成功整合到受体菌基因组中,转化子抗性基因可稳定遗传。结论:最优的转化体系和条件为:IM和CM培养基中AS浓度为200μg/mL,棘孢木霉T4孢子浓度为106/mL,农杆菌浓度为200μL(OD600约0.8),共培养时间为48 h,转化效率约为50个转化子/106个孢子。