农杆菌介导的小麦遗传转化几个影响因素的研究

采用携带gus和 (或 )bar基因双元表达载体 (p330 1,pBTAaB)的 3个根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株(AGL 1,EHA10 5和LBA4 4 0 4 )对普通小麦 (TriticumaestivumL .)冬性栽培品种农大 170和农大 14 6的幼胚及幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明 ,菌液浓度OD60 0 1.0和侵染时间 1h对外植体的生存和转化最为有利 ;侵染前对外植体进行高渗处理较明显地提高了抗性愈伤获得率 ;乙酰丁香酮 (AB)对小麦转化的作用随菌株和外植体的不同而异 ;菌株 /质粒组合、受体基因型及外植体的类型、年龄和生理状态对转化效率有很大的影响。条件优化后 ,得到大量具有PPT抗性的愈伤和一些抗性植株。抗性愈伤的GUS染色阳性率在 5 0 %～ 6 0 %之间 ,所检测的抗性苗呈GUS阳性。对 6株抗性苗的PCR和Southern检测初步证明 ,外源基因已经整合到其中 3株的基因组中。

高效抗虫基因PinⅡ转化水稻的研究

利用农杆菌介导的转化方法对1个籼稻品种和3个粳稻品种进行了转化。所用质粒为pCAMBI1300,其上带有马铃薯蛋白酶抑制剂基因PinⅡ和高效启动子ACTⅠ以及调节子Intron。通过添加有利于转化的物质乙酰丁香酮及影响转化的各因素(农杆菌的培养方法、共培养天数、愈伤组织诱导方法及继代次数)进行综合优化后,建立了农杆菌介导的水稻高效转化体系。将成熟胚用pCAMBI1300/LBA4404浸染后,筛选出抗性愈伤组织并获得转化植株。其中抗性愈伤组织产生率最高达51 8%(粳稻)和31 5%(籼稻),转化植株再生率最高达67 6%(粳稻)和47 5%(籼稻)。初筛苗中PCR阳性苗得率最高达33 3%(粳稻)和27 4%(籼稻)。PCR结果初步表明PinⅡ基因已整合到水稻基因组中。田间抗虫试验初步表明,阳性苗虫害率低于其受体亲本虫害率。本研究还在转基因水稻中发现了性状明显变异的植株,是进行水稻遗传背景分析和优良性状利用的宝贵材料。

γ-维生素E甲基转移酶基因转化花生研究

采用携带γ-TMT和bar基因表达载体pGBVE的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌 株GV3101对花生栽培品种鲁花11和丰花2号的成熟胚小叶片及胚生长点进行遗传转化。受体基因型及外 植体类型对转化效率影响很大,以鲁花11胚生长点的转化率最高。试验获得14株PPT抗性苗,经PCR检测 证明,γ-TMT基因已整合在花生基因组中。

提高根癌农杆菌介导水稻遗传转化频率的研究

以15个籼、粳稻栽培品种作材料,研究了农杆菌转化水稻幼胚愈伤组织频率的一些影响因素。结果表明:NB培养基适用于各种基因型的水稻幼胚培养,愈伤组织与农杆菌共培养时间以3d为宜,而CCS培养基则适合于水稻转化愈伤组织的筛选培养。用羧苄青霉素抑制农杆菌效果优于头孢霉素,其适宜浓度为250～400mg/L,而潮霉素的筛选压以25～50mg/L较为合适。此研究通过优化各种转化因子,已从供试的15个品种中获得了14个品种的水稻转基因植株。

农杆菌介导的菜心遗传转化体系的建立

以建立的菜心高频再生体系为基础,利用GU S染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、乙酰丁香酮(A S)、预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对菜心((B rassica camp estris L.var.p arach inesis)子叶遗传转化的影响,探讨了适宜菜心转化的卡那霉素与抑菌抗生素使用浓度。结果表明,农杆菌菌株AGL 0对菜心的浸染能力最强,添加100μm o l/L的乙酰丁香酮有利于菜心转化;子叶外植体预培养2 d后浸染(菌液浓度OD600值为0.8)15m in,共培养2 d,然后转移到含15 m g/L卡那霉素和100 m g/L T icarc illin的筛选培养基上,进行转化植株的再生,植株再生率及外植体GU S阳性率均较高,是较优的转化条件;本试验共获得8株转化植株,转化率达2.44%,经PCR分析和Sou thern杂交检测表明,GU S基因已整合进入菜心基因组。

提高农杆菌介导番茄遗传转化效率的研究

利用农杆菌介导法对番茄进行遗传转化,比较了不同的农杆菌种类、农杆菌侵染时间、外植体种类及番茄品种对农杆菌侵染效率的影响。转化后得到的再生植株,利用PCR、Southern杂交检测GUS基因是否整和进入基因组。结果表明:农杆菌介导法成功介导了GUS基因导入番茄。农杆菌EHA105侵染番茄的效率明显高于LBA4404,侵染时间3min较好。子叶外植体的转化明显优于下胚轴,黄色串珠樱桃番茄的遗传转化效率高于中蔬5号;优化的转化条件可以使番茄获得较高的遗传转化效率。

根癌土壤杆菌介导的水稻高效转化和转基因植株的高频再生

利用根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)介导的转化方法对 4个粳稻 (OryzasativaL .ssp .japonica)品种和 2个籼稻 (O .sativassp .indica)品种进行了转化。在对影响根癌土壤杆菌转化水稻效率的多种因素进行比较研究后 ,建立了根癌土壤杆菌介导的水稻高效转化和再生系统。将水稻成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织用根癌土壤杆菌EHA10 1/pGIH感染后 ,筛选出抗性愈伤组织并获得转化植株。其中抗性愈伤组织产生频率最高达 5 5 .1% (籼稻 )和 85 .2 % (粳稻 ) ,转化植株产生频率最高达 37.8% (籼稻 )和 6 9.0 % (粳稻 )。GUS染色、转基因植株总DNA的PCR和Southern杂交检测等结果表明 ,T_DNA上的外源基因已整合进了转基因植物基因组中。对转基因T1代水稻植株的遗传分析结果证明外源基因能稳定遗传给后代 ,且大多数株系的分离比符合 3∶1。该转化系统的建立为将外源有用基因导入水稻并高效稳定地表达奠定了基础。

简单高效的根癌农杆菌介导的水稻基因转化方法

本文在研究影响农杆菌介导的水稻转化的主要因素基础上,建立了一套简单、高效的水稻转基因系统。将水稻成熟胚来源的愈伤组织用农杆菌EHA101/pHQ9,EHA 101/pHQ 10,EHA 101/pHQ T3感染后,筛选抗性愈伤,经分化获得转化株。抗性愈伤的平均得率为约100个愈伤/g愈伤外植体,抗性愈伤的分化频率平均高达85%。转基因植株的GUS染色、Southern杂交结果表明,T-DNA上的外源基因已整合进转基因植物的基因组中。转基因植株T1代对潮霉素的抗性表明,多数转基因株系符合孟德尔分离比3∶1。该系统的建立将有助于应用T-DNA标签法和基因打靶法进行水稻功能基因组的研究。

影响农杆菌介导玉米优良自交系遗传转化的因素

以我国玉米骨干自交系9046,齐319,414,Mo17的幼胚为材料,在已经建立的农杆菌介导的玉米幼胚转化体系的基础上,研究了影响农杆菌介导玉米优良自交系遗传转化的因素,建立了优化的玉米优良自交系的遗传转化体系。研究结果表明,1.0-2.0mm的玉米幼胚是最适宜的转化受体;在感染液和共培养基中都加入乙酰丁香酮(200μmol/L)和抗坏血酸(50mg/L),能显著提高农杆菌对玉米的侵染能力;而感染前将幼胚高渗透压预处理未能提高转化率;延迟筛选有利于提高抗性愈伤组织的存活率。应用优化后的转化体系,获得了这4个玉米优良自交系的转基因植株,PCR阳性植株率为1.71%-4.09%。转化植株叶片总DNA的PCR和Southern杂交分析表明,T-DNA上的外源基因已经整合进了玉米基因组,并且在大多数转基因植株(71.4%)中为单位点插入。这一体系的建立,为进一步将有用基因导入玉米优良自交系奠定了基础。

用根癌农杆菌介导获得籼稻转基因植株

用携带p13W 4质粒的根癌农杆菌EHA10 5感染籼稻龙特甫品种的幼胚愈伤组织 ,经共培养并在潮霉素 2 5～ 5 0mg/L浓度条件下筛选 2～ 3次 ,获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织 ,其愈伤组织转化频率为 2 5 .3% ;将抗性愈伤组织转入分 3化培养基培养形成植株 ,经GUS活性测定和PCR检测 。

拟南芥植物硫肽激素基因在玫瑰茄细胞中的表达

利用玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系,通过根癌农杆菌将AtPSK2基因导入玫瑰茄细胞,并获得了功能性表达。研究结果表明,所获得的转基因玫瑰茄细胞系的临界植板细胞密度和临界起始细胞密度分别降低了60%和50%,悬浮细胞培养周期由16d缩短到12d,转化愈伤组织的比生长速率比对照提高了75%,转基因玫瑰茄细胞和愈伤组织中的花黄素含量与对照相比没有发生明显变化。本研究所获得的转基因玫瑰茄细胞系不仅为花青苷和花黄素等次生代谢产物高产细胞株的选育提供出发材料,而且为PSK-α作用机理的深入研究提供一个有用的模型。