AhHDA1异源表达影响拟南芥植株干旱性

将花生组蛋白去乙酰化酶1基因(Arachis hygogaea histone deacetylase 1,AhHDA1)转化拟南芥野生型Col-0和突变体had6,对获得的纯合转基因植株进行抗旱性分析,并对ABA合成及相关响应基因表达进行检测.结果表明:AhHDA1蛋白定位于细胞核,在干旱条件下,与hda6突变体比较,p35S%HDA1/hda6拟南芥植株的叶片相对含水量降低,气孔开度增大,干旱存活率降低,基本回复了Col的表型;体内ABA合成关键酶基因At NCED3和ABA信号途径重要转录因子At ABF3基因的表达降低,但RD29A基因表达提高.而p35S%HDA1/Col较p35S%HDA1/hda6和Col的抗旱性关键生理指标降低更加显著.说明hda6突变体表型回复确实由于外源AhHDA1的表达引起的,推测AhHDA1影响植物抗旱性与ABA的合成与信号通路相关.

花生AhHDA1互作蛋白AhGLK的筛选及特性分析

通过酵母双杂交系统,以花生组蛋白去乙酰化酶AhHDA1为诱饵,对花生cDNA文库筛选并分析互作蛋白的生物学特性。结果获得一个AhHDA1互作蛋白Arachis hypogaea L.Golden 2-like(AhGLK);体外荧光双分子试验证实,AhHDA1与AhGLK蛋白存在相互作用;利用生物信息学软件分析表明,AhGLK含有MYB保守域,其氨基酸序列与大豆(Glyine soja)GsGLK、拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGLK分别具有较高同源性;AhGLK定位在细胞核中并具有转录因子活性,主要在花生的叶片中表达;在30%PEG条件下,AhGLK表达下调。

AhHDA1影响花生毛状根生长的研究

花生组蛋白去乙酰化酶AhHDA1转到花生毛状根中超表达后,短侧根的毛状根比例增加.基因表达检测结果显示,AhHDA1超表达后上调了细胞周期相关基因AhCYCD4和生长素信号转导相关基因AhIAA28的表达水平,而AhARF19的表达水平被显著抑制.进一步通过LUC实验发现,AhHDA1激活AhCYCD4和AhIAA28启动子的活性.说明AhHDA1可能通过调控生长素信号转导和细胞分裂影响花生毛状根侧根的生长.

ChIP-seq分析花生中AhGLK1与AhHDA1调控的下游靶基因网络

花生(Arachis hypogaea L.)是重要的经济油料作物,其生长发育、产量与品质受干旱影响。为深入了解花生的抗旱机理,本研究通过ChIP-seq对组蛋白去乙酰化酶AhHDA1和转录因子AhGLK1富集的DNA序列进行分析,揭示两者调控的下游靶基因网络。通过比对分析,GLK-IP获得6571万clean beads,HDA-IP获得6390万clean beads,Input获得7006万clean beads,唯一比对率分别为74.97%、76.81%和76.75%。GLK-IP获得714个peak, HDA-IP获得543个peak。Peak在基因的外显子、内含子、上游、下游和基因间等功能元件均有分布。GO富集结果显示,AhGLK1-IP和AhHDA1-IP的peak相关基因在分子功能中的富集分别为35.1%和32.8%,在生物学过程中的富集分别为39.3%和44.2%,在细胞组分中的富集分别为25.5%和22.8%。KEGG信号通路富集结果显示,AhGLK1-IP相关基因显著富集在“代谢途径(metabolic pathways)”、“抗生素生物合成(biosynthesis of antibiotics)”、“二羧酸代谢(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)”、“不同环境中微生物代谢(microbial metabolism in diverse environments)”、“碳代谢(carbon metabolism)”、“次生代谢生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)”和“氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)。而AhHDA1-IP相关基因在“N聚糖生物合成(N-glycan biosynthesis)”、“精氨酸和脯氨酸代谢(arginine and proline metabolism)”和“苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)”通路显著富集。AhGLK1-IP和AhHDA1-IP共同富集的peak有4个,在AhGLK1-IP和AhHDA1-IP特异富集的基序(motif)中存在共同的保守序列AGAA/T。研究结果为深入认识AhGLK1和AhHDA1基因的功能和了解花生响应干旱胁迫和旱后恢复生长中的调控机制具有参考价值。

AhHDA1对花生毛状根干旱的生理调节作用

为研究AhHDA1在花生(Arachis hypogaea)干旱胁迫响应中的作用,本文分析了四叶期花生根和叶片在20%(m/V)聚乙二醇6000(PEG6000)模拟干旱胁迫下AhHDA1和干旱响应基因的表达变化,发现AhHDA1、AhAREB1和AhNCED1在叶片中分别上调表达至原来的4.3、2.6和10.3倍,在根中分别下调表达91.1%、87.3%和89.2%。基因表达模式提示AhHDA1可能与脱落酸(ABA)合成和信号传导有关。通过测定干旱胁迫下35S::eGFP、35S::AhHDA1和35S::AhHDA1-RNAi毛状根含水量、ABA含量、抗氧化酶活性、过氧化氢(H_2O_2)含量和丙二醛(MDA)含量,发现35S::AhHDA1-RNAi毛状根具有较高的抗旱性和抗氧化能力,35S::AhHDA1-RNAi在干旱胁迫处理后的含水量为75.3%,脱落酸含量为1.23μg·g^(-1),均显著低于其他两种毛状根,表明抑制AhHDA1表达可提高毛状根细胞的抗旱能力。染色质免疫沉淀(ChIP)分析花生根在干旱胁迫下AhNCED1和AhAREB1启动子区域H3K14ac抗体富集度变化情况,结果表明,AhNCED1和AhAREB1在H3K14位点的乙酰化程度改变分别在转录起始位点(TSS)和近TSS区启动子发生。

AhHDA1异源表达对拟南芥根系生长的影响

AhHDA1是花生中的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC),与拟南芥中的HDA6高度同源,二者都具有保守的组蛋白去乙酰化酶活性结构域。本文对7日龄野生型拟南芥(Col-0)、hda6突变体和AhHDA1异源表达株系AhHDA1/hda6的主根长度和侧根数量进行测量统计。结果表明,以hda6为对照, AhHDA1/hda6的主根生长速度明显减缓,侧根数量也显著减少; AhHDA1/hda6的分生区长度和伸长区的细胞长度与Col-0相近,与hda6突变体相比显著缩短;AhHDA1/hda6根部的细胞周期和生长素极性运输相关基因的表达水平皆显著低于hda6突变体。说明AhHDA1可能影响了生长素极性运输从而下调细胞周期相关基因的表达,抑制根尖分生区的细胞分裂和伸长区的细胞伸长,进而抑制拟南芥主根生长和侧根发生。

AhDREB1与AhHDA1互作调控花生AhGLK1基因表达的研究

为探讨Ah DREB1与Ah HDA1互作调控花生(Arachis hypogaea)Ah GLK1基因表达的机制,利用不同转基因毛状根分析Ah GLK1的表达水平;通过酵母双杂、双分子荧光互补实验分析Ah HDA1和Ah DREB1互作关系;利用双荧光素酶报告基因检测AhHDA1和AhDREB1对Ah GLK1启动子活性的影响。结果表明,在Ah HDA1超表达和Ah DREB1超表达毛状根中,Ah GLK1表达水平显著降低;AhHDA1与Ah DREB1互作,并结合Ah GLK1启动子区域乙烯响应元件(ethylene responsive element,ERE)元件,共同抑制Ah GLK1启动子转录活性,从而调控Ah GLK1的表达。