黄颡鱼源维氏气单胞菌Aha和gyrB基因双重PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测黄颡鱼源维氏气单胞菌(A.veronii)的方法,本研究根据A.veronii菌株RC110724黏附素基因(Aha)和促旋酶B亚单位基因(gyrB)序列设计引物,经条件优化建立了A.veronii的双重PCR检测方法。结果显示该方法可以同时扩增出A.veronii 419 bp和745 bp两条特异性的片段,而对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌、副溶血性弧菌、麦氏弧菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌、柱状黄杆菌、肺炎克雷伯氏菌、无乳链球菌、舒伯特气单胞菌扩增结果为阴性;该方法对A.veronii标准株ATCC35624和RC110724基因组DNA和菌体检测下限分别为6.6×10^(-3)ng/μL和3.2×10~2cfu/mL。利用建立的双重PCR方法对30份临床样品进行检测,结果与细菌传统分离鉴定符合率为100%。同时,双重PCR可以检出菌株RC110724人工感染的黄颡鱼肝、脾和肾组织中的细菌DNA,对肝和脾脏组织的样品检测效果最好。本研究建立的双重PCR检测方法特异性好,具有较高的检测灵敏性,可用于黄颡鱼等A.veronii感染病例的快速诊断和流行病学监测。

拟南芥AHA1基因启动子的表达特性分析

从拟南芥中分离到编码质膜H^+-ATPase的AHAI基因启动子序列813 bp,并构建了此种启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,得到转基因拟南芥。用组织化学方法分析AHA1基因启动子驱动GUS转基因拟南芥的结果表明,GUS基因在转基因的拟南芥根、茎、叶、花和荚的维管组织中均有表达,且不同发育时间内GUS基因表达也不同。以上研究表明拟南芥AHA1基因可能参与植物的生长发育与抗逆胁迫反应。

AHA1转基因拟南芥的抗铝性生理解析

AHA1基因是植物体内编码质膜H+-ATPase的一个重要基因,参与植物的生长发育与抗逆胁迫反应.本文以AHA1转基因型及其野生型拟南芥为材料,研究了铝胁迫对拟南芥养分吸收、抗氧化胁迫和有机酸分泌的影响.结果表明:Al降低了拟南芥根系对N、K、Ca和Mg的吸收,但增加了根系对P的吸收,且AHA1转基因型拟南芥比野生型积累更多的P和较少的Al.铝胁迫诱导拟南芥抗氧化酶SOD和POD活性增加,转基因型与野生型之间没有明显差异.Al对拟南芥有机酸分泌具有明显的诱导作用,且AHA1转基因型分泌较多的有机酸.质膜H+-ATPase的活性抑制剂钒酸盐对拟南芥有机酸分泌具有明显的抑制作用;而Zn2+、Mg2+可促进Al对拟南芥有机酸分泌的诱导,并部分恢复钒酸盐的抑制效应.说明AHA1基因通过增加拟南芥根系对P的吸收以及有机酸分泌,提高了植物的抗铝性.

芸薹属原花青素跨膜转运蛋白TT12、AHA10基因家族RNA干扰载体的构建

拟南芥TT12和AHA10基因分别编码MATE类型和H+泵类型的跨膜转运蛋白,介导原花青素单体向液泡的转运,对种皮色素的积累起重要作用。甘蓝型油菜是重要的油料作物,但缺乏黄籽基因型,现有黄籽材料表型不稳定,黄籽性状的分子机理不清,缺乏相关的分子育种。克隆了芸薹属TT12和AHA10基因家族的RNA干扰载体片段BTT12I和BA-HA10I,以基于pFGC5941而改造的植物RNA干扰基础载体pFGC5941M为骨架,构建了相应的RNAi载体pFGC5941M-BTT12I(简称pBTT12I)和pFGC5941M-BAHA10I(简称pBAHA10I),通过分子鉴定后转化农杆菌,获得工程菌株,有利于通过基因沉默技术研究TT12和AHA10基因在芸薹属种皮色素跨膜转运中的作用和机理,探索黄籽性状的分子育种。

苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究

通过PCR从苋属植物千穗谷 (Amaranthushypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜凝集素 (AHA)的核基因片段。序列分析结果表明该基因为 2 45 3bp ,含有一 15 38bp的内含子和两个分别为 2 12bp和 70 3bp的外显子。采取反向PCR的方法获得仅含该基因的编码区克隆。以此为基础与二元表达载体 pBin438构建含内含子与不含内含子AHA基因的植物表达载体 pBAHAg和pBAHAc并通过土壤农杆菌介导转化了烟草。转化再生植株的PCR和Southernblot分析表明 ,AHA基因已整合到烟草的染色体中 ,有单拷贝和多拷贝的整合。用与AHA蛋白高度同源的ACA蛋白的抗血清进行了免疫斑点 (Immunodotblot)检测 ,结果初步表明转基因烟草有AHA蛋白的表达。虫试结果表明转pBAHAg和 pBAHAc烟草对蚜虫的平均抑制率分别达 5 7 2 %和 48 8% ,有的高达 90 %以上。

Aha1基因过表达对黑色素瘤细胞凋亡的影响

目的研究Aha1基因在恶性黑色素瘤形成过程中的作用。方法采用定量PCR和免疫印迹的方法检测并比较小鼠B16F10移植恶性黑色素瘤及瘤旁的组织中Aha1基因的表达。在恶性黑色素瘤B16F10细胞中转染转染真核表达载体过表达Aha1基因后,使用CCK-8法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡。结果Aha1在恶性黑色素瘤中的表达显著低于相应的瘤旁组织,过表达的Aha1基因导致黑色素瘤细胞的生长停滞,并促进黑色素瘤细胞B16F10的凋亡。结论低表达的Aha1基因有利于恶性黑色素瘤的形成。

猪殃殃对AHAS抑制剂靶标抗性的快速分子检测

为建立猪殃殃靶标抗性快速检测方法,并明确小麦田猪殃殃Galium aparine var.tenerum对AHAS抑制剂靶标的突变类型及分布,从河南、陕西、安徽、江苏和山东5省不同田块采集疑似对AHAS抑制剂产生抗性的猪殃殃植株,采用特异性引物PCR扩增靶标酶AHAS基因保守区片段,并以直接测序法检测采集样品,通过与拟南芥AHAS基因序列比对分析后明确其突变位点。结果显示,在5省25个农田的样品中共有19个农田检测到AHAS突变,分布在河南、安徽和江苏3省;在检测样品中发现突变发生在2个位点,共有3种突变类型,分别是197位脯氨酸(CCC)突变为丙氨酸(GCC)或丝氨酸(TCC),或者是574位色氨酸(TGG)突变为亮氨酸(TTG),检测结果与田间药效反应基本一致。这种用特异性引物扩增目的片段测序的方法,由于其可以在生长当季进行检测,适用于田间靶标突变抗性猪殃殃的快速检测与监测。