苏云金芽胞杆菌AiiA蛋白对魔芋软腐病菌的抗病活性

AiiA蛋白通过破坏病原菌的信号分子来阻断病原菌的群体感应调节系统,达到抗病的目的,是一种新型的抗病蛋白.根据蜡状芽胞杆菌ATCC14579基因组中aiiA序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌中成功扩增出aiiA基因,其ORF为753bp,测序后经blast检测与已发表的序列相似性均在95%以上.将此基因克隆到pET28a表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,超量表达的蛋白在菌体中以包涵体形式存在,纯化的AiiA蛋白经SDS PAGE电泳检测,表达产物分子量为28×103,致病性测定表明该蛋白对魔芋软腐病菌CZY具有较强的抗病活性.

重组AiiA蛋白可溶性表达及发酵条件优化

通过摇瓶培养确定重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA表达AiiA蛋白可溶性表达的最优化条件,考察以牛肉膏蛋白胨为基础培养基添加不同种类的碳源、不同浓度的磷酸钾缓冲液(pH7.0)、微量元素、乙酸以及调整牛肉膏蛋白胨的比值对AiiA蛋白可溶性表达的影响,并用15 L发酵罐进行补料分批发酵,确定高密度发酵工艺条件。结果表明:优化发酵培养基为蔗糖10 g/L,牛肉膏7.8 g/L,蛋白胨31.2 g/L,NaCl 5 g/L,K2 HPO4.3H2 O 14 g/L,KH2 PO4 5.3 g/L,4 mL/L微量元素。优化后AiiA蛋白可溶性达4.31 mg/mL。在15 L发酵罐补料分批发酵培养中,诱导24 h时,发酵菌OD600达到18.5,可溶性蛋白表达量5.9 mg/mL,占AiiA总蛋白50.7%,实现了扩大培养。

在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白

【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白,能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性,即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏云金芽胞杆菌片段,本文构建了解离载体pBMB5401,并将上述两个融合基因单独或同时装入解离载体pBMB5401,分别得到重组质粒pBMBcaiiA,pBMB3aiiA和pBMB3439。转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,随后导入温度敏感型辅助质粒pEG922,重组质粒在整合酶的作用下发生体内重组,消除了抗性基因等非必需片段。【结果】得到3个重组菌BMBcaiiAR,BMB3aiiAR和BMB3439R,在无抗性选择压力下的稳定性均在90%以上。融合蛋白SLH-AiiA及pro3A-AiiA在解离后的重组菌中得到表达,具有对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力。【结论】在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白,可增强其对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力,当同时结合两种方式来表达AiiA蛋白时效果最好。

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.

AiiA融合蛋白包涵体变性和复性的研究

通过IPTG诱导含有pGEXaiiA-B15质粒的工程菌使其大量表达AiiA融合蛋白.由于所表达的融合蛋白多为不可溶的包涵体,须经分离、变性溶解,再经过一个合适的复性过程才能实现变性蛋白的正确折叠,得到具有生物活性的蛋白.通过含N-十二烷基肌氨酸钠的缓冲液A溶液及尿素等变性剂使包涵体溶解,磷酸盐缓冲液透析复性.SDS-PAGE电泳表明包涵体已由不可溶转化成可溶的蛋白.抑菌试验证明复性后的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌引起的马铃薯软腐病有较明显的抑制作用.

重组毕赤酵母AiiA蛋白表达量的双抗体夹心ELISA测定

利用双抗体夹心ELISA的方法，建立了能对重组毕赤酵母表达AiiA蛋白进行定量测定的方法．双抗体夹心ELISA方法建立的标准AiiA蛋白曲线显示，随着AiiA蛋白质量浓度增大，显色后A410值增大，在AiiA质量浓度为1．11—35．5μg·mL-1的范围内具有良好的线性关系．经方法学分析表明，该方法对合有AiiA蛋白的发酵样品的检测具有良好的特畀性和精确度，AiiA的检测限为0．80μg·mL-1，批内差畀系数和批间差异系数分别为5．22％和10．30％．测定8．86，2．22，1．11μg·mL-13个质量浓度回收率分别为104％、97．3％和102％，能够满足定量要求．

AiiA蛋白对铜绿假单胞菌毒力因子生成的影响

目的构建苏云金杆菌AiiA基因的真核表达载体并转染A549细胞，观测真核细胞表达的AiiA蛋白对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,pa）密度感应（quorum sensing）系统酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactone，AHL）信号分子及毒力因子合成的影响。方法质粒pET-AiiA经Nhe Ⅰ与Xho Ⅰ酶切后，将AiiA基因片段连接入真核表达质粒pEGFP-N2，脂质体转染A549细胞，提取细胞蛋白，Western blot检测AiiA蛋白表达。将蛋白提取物加入凡培养物中，观察Pa AHL信号分子及毒力因子绿脓素、弹性蛋白酶的生成情况。结果AiiA基因片段成功克隆入真核表达质粒pEGFP-N2，转染该质粒后的A549细胞能够表达AiiA蛋白，且该蛋白能够降低凡培养物中AHL信号分子水平，且绿脓素和弹性蛋白酶的生成减少。结论本研究成功构建了真核表达质粒pEGFP-N2-AiiA，转染细胞后表达的AiiA蛋白能够水解AHL信号分子，减少凡毒力因子的生成，故具有抗Pa感染的潜在价值。

aiiA基因在植物软腐病研究中的应用进展

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是一类广泛存在于许多革兰氏阴性细菌群体感应系统中的信号分子,又称作自体诱导物(Autoinducer,AI)。aiiA基因编码的AiiA蛋白能降解细菌产生的AHLs信号分子,干扰该信号分子参与细菌群体感应的调控过程,抑制多种植物病原菌致病基因的诱导表达,从而减轻或消除病原菌的致病性。本文介绍了aiiA基因、AiiA蛋白的研究情况,以及aiiA基因在抗软腐病工程菌和转基因植物研究上的应用现状,并提出了提高植物抗软腐病的研究方向。

表达aiiA基因多黏芽胞杆菌工程菌构建与功能分析

AiiA蛋白能够专一性地水解革兰氏阴性菌分泌的信号分子,从而抑制其致病基因的表达,减弱致病性。根据NCBI上公布的蜡状芽胞杆菌ATCC14579的aiiA序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis NBIN-861中扩增得到aiiA基因(GenBank登录号:MG704113),全长基因约750 bp。将aiiA基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a和芽胞杆菌表达载体pBMB1A中,构建重组表达载体pETaiiA和pBMaiiA,pETaiiA转化大肠杆菌BL21(DE3),pBMaiiA转化多黏类芽胞杆菌NR1,获得重组工程菌BLaiiA和BPaiiA。SDS-PAGE和蛋白质谱鉴定表明AiiA蛋白均成功表达,利用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有水解N-酰基高丝氨酸内酯活性。其中纯化的AiiA蛋白(1.13 mg/mL)和重组菌BPaiiA浓缩的发酵上清液中的AiiA蛋白活性较高(透明圈直径分别为16和18 mm),马铃薯致病性试验和抑菌试验结果表明该蛋白对胡萝卜欧文氏菌具有一定的抗病活性,但不具有抑菌活性。多黏芽胞杆菌NR1和重组菌BPaiiA发酵产生的抑菌物质含量均为1.2%～1.3%,具有良好的抑菌效果。本研究为构建更有效的生物防治菌株奠定了理论基础。

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.