匍枝筋骨草再生体系构建

为了提高匍枝筋骨草繁殖速度,在短期内获得大量试管苗,为种质资源的安全和有效保存提供技术指导。本研究以匍枝筋骨草为试验材料进行组培试验。用匍枝筋骨草叶片培养获得了组培苗,建立起了良好的扩繁体系。结果表明,采用匍枝筋骨草嫩叶为外植体,3%NaClO处理10min可达到较好的消毒效果。诱导不定芽增值的最适培养基为MS+6-BA1mg/L,增殖率高;诱导愈伤的最适培养基为MS+6-BA1mg/L+2,4-D0.4mg/L,所得愈伤组织大而绿,长势良好;诱导生根的最适培养基是MS+IBA0.4mg/L,所得根系发达,植株健壮。本实验建立了完整的匍枝筋骨草植株再生体系,为匍枝筋骨草的大规模生产奠定了基础。

匍枝筋骨草悬浮培养中β-蜕皮甾酮的积累与调控

植物源蜕皮激素——β-蜕皮甾酮(β-EC)是一种细胞生长调节激素,在医疗和生物农药等方面有极高的应用价值。利用匍枝筋骨草细胞中含有较高β-EC这一特性,为从改善细胞悬浮培养、监测及加入添加物等途径找出一个可以高效、快速生产β-EC的生物学方法,通过紫外分光光度法和高效液相色谱等研究方法在前期已建立的匍枝筋骨草细胞悬浮培养体系的基础上,进一步研究了细胞培养过程中的营养消耗、次生代谢产物生成的动力学曲线;并探索了向细胞悬浮培养体系中添加L-苯丙氨酸(L-PAL)、甲羟戊酸(MVA)、α-蒎烯、松油醇、NO(硝普钠SNP)等来提高匍枝筋骨草细胞中β-EC含量。结果表明:匍枝筋骨草细胞生长符合逻辑斯蒂方程曲线"S"型,生长周期共19 d并在第11天进入细胞生长稳定期;电导率与细胞干质量、蜕皮甾酮的积累呈负相关,因而,可利用电导率的变化确定最佳细胞收获时间;多次继代会弱化细胞生产蜕皮甾酮的能力;通过将α-蒎烯、MVA、SNP联合添加于弱化的细胞中,可以显著提高细胞悬浮培养体系中β-EC的含量,联合添加的适宜组合和最优浓度为:α-蒎烯50μL/L、MVA 10 mg/L、SNP 80μmol/L。

匍枝筋骨草悬浮培养生产蜕皮甾酮的研究

为得到生长迅速、生物量大、蜕皮甾酮含量高的匍枝筋骨草(Ajuga lobata D.Don)细胞系,从固体培养基选择、激素种类筛选出筋骨草颗粒状的胚性愈伤组织,再从培养基类型、激素配比和接种量3个方面优化悬浮培养体系。试验结果表明:添加0.4 mg/L 2,4-D的MS固体培养基可以诱导匍枝筋骨草组培苗的根段产生松散的颗粒状胚性愈伤。比较细胞系在WPM、MS、1/2MS 3种液体培养基中的生长状况,确定MS为最佳的悬浮培养基。2,4-D对细胞生长有显著影响,细胞生物量可达到添加NAA生物量的1.3倍;其与6-BA配比对筋骨草细胞的影响研究结果表明,随着6-BA的浓度增加,蜕皮甾酮的含量随之增加,其中,添加0.5 mg/L6-BA的筋骨草细胞中蜕皮甾酮含量与不添加6-BA的对照相比,差异显著(P<0.05);添加1 mg/L 6-BA积累的蜕皮甾酮与对照组差异极显著(P<0.01)。因此,0.4 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA为悬浮培养的最优激素配比,培养7天后细胞生物量净增长生物量可达到(4.3652±1.0739)g,蜕皮甾酮含量可达到(4.5692±0.2044)mg/g,所形成的细胞系更均一且繁殖速率最快。接种量为15%时,细胞长势好,鲜重增殖倍数达3.45,第7天细胞生长速率达1.109 g/d,为最适的接种量。试验建立了生长迅速、悬浮液均一的匍枝筋骨草细胞悬浮培养体系,适于蜕皮甾酮的大量生产。

茉莉酸甲酯对匍枝筋骨草细胞生长和β-蜕皮甾酮积累的影响

匍枝筋骨草悬浮细胞中含有较高β-蜕皮甾酮,为了进一步提高其β-蜕皮甾酮含量,通过添加茉莉酸甲酯(MeJA)进行一系列试验研究。以4~10代筋骨草悬浮细胞为试验材料,测定不同处理浓度和处理时间的MeJA对细胞生长、β-蜕皮甾酮积累的影响,细胞生长量采用称量计数,β-蜕皮甾酮含量则使用高效液相进行检测。结果表明:匍枝筋骨草悬浮细胞生长曲线及β-蜕皮甾酮积累曲线符合Logistics模型。在细胞快速生长的初始期(第4天)或中期(第7天)添加不同浓度的MeJA,对细胞生长影响相对较小,生长曲线均有小高峰,分别出现在处理后第5天和第3天,干物质积累量分别达到0.60和0.62g。而在细胞快速生长的高峰期添加MeJA,细胞生长曲线呈下降趋势,细胞鲜重和干重显著低于CK(P<0.05)。在细胞快速生长的初始期或中期添加MeJA后细胞鲜重与β-蜕皮甾酮积累量呈显著相关。在细胞快速生长的初始期或中期添加10~50μmol·L-1 MeJA后,细胞鲜重与CK对比表现为显著增加,其中添加50μmol·L-1 MeJA后细胞鲜重最佳,最高可达到35.90g,显著高于其他处理(P<0.05)。而同样条件下β-蜕皮甾酮表现为积累量小幅增加,最高量为0.5095mg·g-1。添加100~200μmol·L-1MeJA均会抑制细胞的生长,其中添加200μmol·L-1 MeJA细胞鲜重与CK相比显著下降,抑制率最高可达到38.88%。而添加100~200μmol·L-1 MeJA后β-蜕皮甾酮积累量表现为大幅提升,最高可达3.5315mg·g-1,为同期CK的14.44倍(P<0.01)。在细胞快速生长的高峰期添加10~200μmol·L-1 MeJA后,细胞鲜重与CK相比都表现为下降,说明在此时添加这些浓度MeJA可抑制细胞的生长,最高抑制率可达31.01%。而在细胞快速生长的高峰期添加10~50μmol·L-1 MeJA后,β-蜕皮甾酮积累量可在短时间内大量激增,β-蜕皮甾酮积累量最高达到1.4136mg·g-1,是CK的5.06倍(P<0.01)。添加100~200μmol·L-1 MeJA则积累量较少。在细胞快速生长的中期添加100μmol·L-1 MeJA条件下对细胞的刺激较小,β-蜕皮甾酮积累量最高,达到3.5315mg·g-1。

外源ABA对匍枝筋骨草悬浮细胞内源激素及蜕皮甾酮的影响

通过分别向匍枝筋骨草悬浮培养体系中添加不同浓度的脱落酸(ABA)并测定添加后不同时间悬浮细胞的生长状况和生物量,以及蜕皮甾酮(20E)和ABA的浓度变化,筛选出最适宜添加浓度.通过测定悬浮细胞内玉米素(ZR)、赤霉素3(GA3)和吲哚乙酸(IAA)及20E的含量变化,探讨ABA对匍枝筋骨草悬浮细胞生长的影响.结果表明,添加0.15 mg·L-1ABA后细胞生长速度减缓,但在未褐化期ABA促进20E的累积,在第48 h和72 h悬浮细胞中20E含量显著地高于对照组,但在第96 h悬浮细胞出现褐化现象,20E含量下降极显著地低于对照组;向匍枝筋骨草悬浮体系中加入外源ABA,悬浮细胞内ABA含量呈上升趋势,ZR,GA3,IAA含量呈相对下降趋势;在相同条件下添加ABA抑制剂(Na_2WO_4),则ABA,ZR,GA3和IAA的变化趋势与添加ABA相反,对20E的影响不显著.

ABA对匍枝筋骨草防御酶活性及蜕皮激素合成的影响

向培养了7 d的匍枝筋骨草悬浮细胞培养体系内分别添加0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/L的ABA,以研究ABA对匍枝筋骨草细胞防御系统的作用及ABA对蜕皮激素合成的影响.试验结果表明：向培养7 d的悬浮体系中,添加0.1-0.4 mg/L的ABA后,悬浮细胞第4天出现褐化;添加0.5 mg/L的ABA后,第3天出现悬浮细胞褐化现象;添加不同质量浓度的ABA后第4天测其悬浮细胞生长量均与对照差异不显著;添加不同质量浓度ABA后悬浮细胞的SOD,POD和CAT活性在48 h内均显著上升,而PAL活性变化在2-24 h间不显著,后上升;添加不同质量浓度的ABA可使筋骨草悬浮细胞的蜕皮激素含量增高,而添加0.1 mg/L ABA,其蜕皮激素含量增高最为显著.

生长调节剂和培养方式对匍枝筋骨草生根及β-蜕皮激素量的影响

目的研究不同质量浓度吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)以及培养方式对匍枝筋骨草生长和β-蜕皮甾酮量的影响。方法以MS为基本培养基,添加IBA(0.5、1.0、2.0 mg/L)或NAA(0.3、0.6、0.9 mg/L)进行组织培养,HPLC法测定匍枝筋骨草中β-蜕皮甾酮量。并比较不同生长调节剂以及组织培养、水培不同培养方式下匍枝筋骨草生根情况与β-蜕皮甾酮量的变化。结果以MS为基本培养基,添加生长调节剂IBA0.5～1 mg/L时,适宜匍枝筋骨草生根。IBA质量浓度为2 mg/L时,匍枝筋骨草根中β-蜕皮甾酮量最高。组织培养条件下,匍枝筋骨草全株及根部的蜕皮激素量均达水培苗的2倍,实生苗的3倍。结论适宜适量浓度的IBA可以促进匍枝筋骨草根的生长,组织培养条件下,匍枝筋骨草根中β-蜕皮甾酮量最高。