抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬的影响及机制

目的探讨抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬中的影响。方法分离培养纯种新西兰兔腹腔原代巨噬细胞并分为4组,加入磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μmol/L)组、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂雷帕霉素(10 nmol/L)组、蛋白激酶B(Akt)抑制剂曲西立滨组(20μmol/L)以及空白对照组。共培养4 h、12 h后分别收集细胞,运用透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,细胞免疫荧光法检测微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)分子的表达,Western blot检测Akt、mTOR、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(pmTOR)及自噬相关蛋白Beclin-1和自噬蛋白Atg5-Atg12连接体的表达,单丹酰尸胺(MDC)染色法观察自噬溶酶体的变化。结果与空白对照组相比,透射电镜下LY294002组自噬体、自噬空泡、髓磷脂图像等自噬标记物明显减少,雷帕霉素组、曲西立滨组明显增多;激光共聚焦显微镜下LY294002组LC3Ⅱ表达显著减少,雷帕霉素组、曲西立滨组表达显著增多;Western blot结果显示LY294002组Beclin-1及Atg5-Atg12蛋白表达水平显著下降,p-mTOR、p-Akt蛋白表达显著减少;雷帕霉素组、曲西立滨组Beclin-1及Atg5-Atg12蛋白表达水平明显上调,共培养4 h后pAkt表达增多,雷帕霉素组p-mTOR表达增多,曲西立滨组减少;共培养12 h后雷帕霉素组、曲西立滨组p-mTOR表达显著减少,雷帕霉素组p-Akt表达显著增多,曲西立滨组显著减少;MDC染色显示LY294002组自噬溶酶体明显减少,雷帕霉素组、曲西立滨组明显增多。结论抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能促进兔原代巨噬细胞自体吞噬,抑制PI3K能减少兔原代巨噬细胞自体吞噬,可能是不同类型的PI3K分子通过其他通路起作用。

AK092375通过膀胱癌GLUT3的表达对NF-κB/TCS2/mTOR信号通路相关因子的影响

目的观察长链非编码RNA(lncRNA)AK092375在膀胱癌细胞中的表达及其通过葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)的表达对NF-κB/TCS2/mTOR信号通路相关因子的影响。方法2020年1月—2021年5月于内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心进行相关实验。选择AK092375表达量最低的膀胱癌细胞系T24作为研究对象,并与人正常膀胱上皮细胞SV-H、UC-1进行比较。取培养生长良好的T24细胞随机分为A组(AK092375和GLUT3同时过表达)、B组(AK092375和GLUT3同时干扰)、C组(AK092375过表达而GLUT3干扰)、D组(AK092375干扰而GLUT3过表达)4组。通过RT-PCR和Western-blot法检测各组细胞GLUT3及下游NF-κB/TCS2/mTOR信号通路(NF-κB、TCS2、mTOR)mRNA和蛋白表达水平;并分析各组膀胱癌细胞的增殖和迁移情况。结果Western-blot检测结果显示,AK092375和GLUT3蛋白在人膀胱癌细胞系T24的表达量明显高于人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1(t/P=3.215/<0.001、2.538/<0.001)。GLUT3、NF-κB、TCS2、mTOR mRNA和蛋白表达水平比较,A组>D组>C组>B组,且各组间比较差异有统计学意义(mRNA:F/P=25.940/<0.001、28.444/<0.001、23.919/<0.001、16.853/<0.001;蛋白:F/P=7.070/<0.001、7.497/<0.001、33.717/<0.001、12.519/<0.001)。膀胱癌细胞的迁移率和增殖情况比较,A组>D组>C组>B组,各组间比较差异均有统计学意义(F/P=9.704/<0.001,3.265/<0.001)。结论AK092375可能通过上调GLUT3的表达,从而激活下游NFκB/TCS2/mTOR信号通路,进而促进膀胱癌细胞的增殖和转移。

lncRNA-CCAT1通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响及其可能作用机制。方法:培养宫颈癌HeLa细胞,将CCAT1过表达质粒pcDNA3.1-CCAT1转染至HeLa细胞中,采用qRT-PCR检测转染后细胞中CCAT1的表达水平;CCK8法检测细胞增殖活性;单丹磺酰戊二酸(MDC)染色观察细胞自噬囊泡的聚集情况;Western blot分析CCAT1过表达和PI3K特异性抑制剂LY294002对HeLa细胞自噬以及PI3K/Ak/t mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。结果:过表达CCAT1可显著增加HeLa细胞中CCAT1表达水平并促进细胞增殖,抑制细胞自噬囊泡聚集,降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ以及下调Beclin1蛋白表达水平,同时上调p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达。然而,采用LY294002干预可逆转CCAT1过表达对HeLa细胞增殖的促进作用以及自噬的抑制作用。结论:CCAT1过表达可能通过激活PI3K/Ak/t mTOR信号通路抑制宫颈癌HeLa细胞自噬。

血管软化丸调控PI3K/Akt/mTOR通路影响细胞自噬及抗动脉粥样硬化的作用机制研究

目的通过观察血管软化丸对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的调控,研究血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制。方法动物实验,观察各组小鼠主动脉横截面病理损伤程度,观察血管软化丸对小鼠主动脉组织Akt、mTOR mRNA和蛋白质表达。体外实验,观察血管软化丸含药血清、Akt抑制剂康士得、mTOR抑制剂雷帕霉素及mTOR-siRNA对小鼠RAW264.7巨噬细胞的影响,观察巨噬细胞自噬体的变化,观察含药血清对巨噬细胞微管相关蛋白LC3-II表达的影响,观察含药血清对巨噬细胞Akt、mTOR、微管相关蛋白LC3-II及自噬相关蛋白Beclin 1的表达的影响,观察含药血清对巨噬细胞分泌炎症因子水平的影响。结果动物实验显示:血管软化丸组动脉粥样硬化病变程度明显较轻。与对照组比较,血管软化丸组小鼠主动脉组织Akt和mTOR表达水平明显较低(均P<0.05)。体外实验发现,与对照组相比,血管软化丸含药血清组和各抑制剂组透射电镜下观察到自噬体数量明显较大(均P<0.05),巨噬细胞微管相关蛋白LC3-II和Beclin1表达明显升高(均P<0.05),而Akt及mTOR的mRNA及蛋白表达水平明显较低(均P<0.05),巨噬细胞分泌的炎症因子IL-10水平明显高低(P<0.05),而炎症因子IFN-γ水平明显较高(P<0.05)。结论血管软化丸通过抑制炎症反应治疗动脉粥样硬化的分子机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,调节巨噬细胞自噬,减少斑块巨噬细胞浸润有关。

黄芪甲苷介导Akt/mTOR/HIF-1α通路调控氧糖剥夺PC12细胞自噬的机制研究

探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AS-Ⅳ)对氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)诱导的PC12细胞自噬损伤的保护作用及可能机制。体外建立OGD PC12细胞自噬损伤模型,PC12细胞分为正常组,OGD组,AS-Ⅳ低、中、高剂量组,阳性药右美托咪定(DEX)组。MTT法检测PC12细胞存活率,透射电子显微镜观察自噬小体及自噬溶酶体,MDC荧光染色法观测自噬小体的荧光强度,Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、HIF-1α自噬相关蛋白表达情况。与正常组比较,OGD组细胞存活率显著降低(P<0.01),自噬小体显著增多(P<0.01),MDC荧光强度显著增强(P<0.01),Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α显著上调(P<0.05或P<0.01),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR显著下调(P<0.05或P<0.01)。与OGD组比较,AS-Ⅳ低、中剂量组及DEX组细胞存活率显著提高(P<0.01),自噬小体显著减少(P<0.01),MDC荧光强度显著减弱(P<0.01),Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α显著下调(P<0.05或P<0.01),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR显著上调(P<0.01)。AS-Ⅳ低、中剂量可通过激活Akt/mTOR,继而影响HIF-1α,抑制OGD诱导的PC12细胞自噬损伤,发挥抗神经元自噬损伤的保护作用;AS-Ⅳ高剂量组与OGD组相比差异无统计学意义。该研究可为AS-Ⅳ防治OGD诱导的细胞自噬损伤提供一定的靶标参考,为黄芪及AS-Ⅳ的二次开发积累一定实验室数据。