新型阿卡斑病毒NSs蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】对新型阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)非结构蛋白(non-structura,NSs)进行生物信息学分析,进而制备抗多克隆抗体,为新型AKAV检测及功能研究提供必要材料。【方法】使用蛋白生物信息学在线分析网站,对新型AKAV NSs蛋白进行系统分析。克隆NSs全长基因,利用大肠杆菌表达系统表达NSs重组蛋白,优化蛋白诱导条件并分析重组蛋白的可溶性;收获破碎菌体,经8 mol/L尿素变性、Ni 2+-NTA亲和层析纯化、透析及浓缩后进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;将纯化的重组NSs蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;应用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)测定多克隆抗体效价及特异反应性。【结果】生物信息学分析表明,NSs蛋白由91个氨基酸残基构成,等电点为12.10,属于碱性蛋白,不稳定指数约为79.04,平均亲水性为指数为―0.059,为不稳定的亲水蛋白;无跨膜区和信号肽,属于非分泌蛋白。试验成功构建了NSs蛋白原核表达载体pET-32a-NSs,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定显示,成功表达重组NSs蛋白,分子质量为29.3 ku,主要以包涵体形式存在,与生物信息学分析结果一致;制备的多克隆抗体效价可达1∶16384000,Western blotting和IFA结果表明所制备抗体能够与NSs蛋白发生特异性反应,具有较好的特异性。【结论】试验成功获得纯化的新型AKAV NSs蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性;制备获得效价高、特异性好的多克隆抗体,为后续新型AKAV疫苗开发、检测及NSs蛋白功能研究提供了基础。

阿卡斑病毒研究进展

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)可感染多种家养动物及野生动物,引起动物流产、早产、死胎、胎儿先天性畸形及脑脊髓炎等临床症状。AKAV以蚊虫和库蠓为主要传播媒介,已在多个国家地区被报道,严重影响家畜养殖业并造成了较大的经济损失。因AKAV分布广泛,危害较大,其感染引起的阿卡斑病(Akababe disease,AKAD)已是世界动物卫生组织(WOAH)法定通报的疾病之一。对AKAV的病原学、流行病学、临床症状、致病机制及诊断方法进行综述,以期为AKAD的预防与控制提供参考。

赤羽病研究进展

赤羽病是由阿卡斑病毒引起的一种牛羊繁殖障碍和新生幼畜畸形传染病。该病在非洲大陆、中东、东南亚、亚洲和南美洲等温带和热带地区的许多国家流行,在我国部分区域流行。阿卡斑病毒通过蚊、蠓等媒介昆虫进入宿主体内,引发母畜出现流产、早产、死胎、畸形胎等现象,给牛羊养殖业造成较大的经济损失。为全面了解赤羽病,该文通过病毒特征、流行病学、致病机理、诊断方法和防控等方面展开论述,旨在为我国有效防控该病提供参考。

赤羽病诊断技术研究进展

赤羽病(AKAD)是由赤羽病毒(AKAV)引起的一种虫媒传染病,该病主要分布于温热带地区。随着全球变暖,该病流行范围不断扩大,对牛、羊繁殖育种造成威胁,严重影响我国畜牧业的快速发展。由于目前没有有效的治疗方法且国内尚无疫苗可用,病毒检测成为了防控该病的重要环节。同时赤羽病毒具有与同科其他病毒基因重配的特性,这给该病的诊断和防控带了更大的挑战。因此,论文结合近年来国内外研究,从病原学、免疫学、分子生物学等方面对赤羽病毒检测技术进行探讨,并介绍了不同检测技术的运用优势和局限性,以期在临床诊断、实验室检测和海关检疫等领域中为诊断和防控AKAV提供理论依据和技术指导。

阿卡斑病毒培养特性和灭活疫苗免疫效果评估

为制备一种阿卡斑病毒灭活疫苗并初步评价其免疫效果,本研究应用组织半数感染量(TCID_(50))测定的方法对阿卡斑病毒CX-01株在HmLu-1、Vero、BHK-21细胞上的扩繁规律进行判定,研究病毒在终浓度0.002 mol/L的BEI灭活剂、37℃条件下的灭活规律,然后应用ISA 206佐剂乳化制备疫苗,通过小鼠模型评估抗原中的添加剂蔗糖、海藻糖和左旋咪唑对免疫效果的影响。结果:HmLu-1细胞培养病毒效价最高为10^(6.75)TCID_(50)/mL,优于Vero和BHK-21细胞;终浓度为0.002 mol/L的BEI灭活剂处理5 h即可完全灭活病毒,为确保对阿卡斑病毒的灭活完全彻底,在BEI灭活剂用量和灭活条件不变的前提下,选择最优的灭活时间为8 h;添加5%蔗糖、5%海藻糖、1%左旋咪唑的疫苗组免疫效果最好,平均中和抗体滴度为18.0。本研究结果对阿卡斑病毒的培养和灭活疫苗的制备具有一定的借鉴意义。

赤羽病病毒Gc aa465~704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465~704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc aa465~704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc aa465~704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。

赤羽病病毒G1蛋白生物信息学分析及截短基因的真核表达

为得到赤羽病病毒(AKV)G1蛋白的截短表达产物作为诊断抗原,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等技术手段,成功克隆出优势抗原结合表位区Thr189-Val 397对应的目的基因G1-2。将目的基因克隆至昆虫杆状病毒表达载体pFastBac HTB,将该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-AKV-G1-2,用Cellfectin ReagentⅡ介导转染sf9细胞,获得重组蛋白,Western blot法检测和分析重组蛋白表达情况。软件分析结果表明189~397 aa肽段为亲水性蛋白,存在跨膜区,该蛋白存在多个潜在的磷酸化位点,具有丰富的潜在抗原表位,属于优势抗原肽段,选取该肽段进行截短真核表达,以AKV抗体阳性血清进行Western blot鉴定,重组蛋白能被特异性识别,出现预期蛋白反应条带,表明G1-2蛋白成功表达,分子量约为27 kDa。本研究为进一步开展截短表达产物为抗原的赤羽病病毒诊断试剂研制奠定了基础。

赤羽病琼脂免疫扩散试验诊断方法的研究

应用引自美国和日本的赤羽病毒和标准阳性血清 ,制备了琼脂免疫扩散试验 (AGID)抗原和高免阳性血清 ,建立了赤羽病AGID诊断方法。应用此方法对上海、杭州、广州等地的 1383头牛进行了检疫 ,AGID抗体阳性牛 746头 ,阳性率为5 4.0 % ,与流行情况相符。同时对从澳大利亚、美国、新西兰和加拿大等国进口的牛、羊、猪血清 16 2头份进行了检疫 ,全部为AGID抗体阴性。

赤羽病微量病毒中和试验诊断方法的研究

应用引自日本的赤羽病病毒 ,制备了微量病毒中和试验抗原和高免阳性血清 ,建立了赤羽病微量病毒中和试验诊断方法。应用此方法对广东省 72 4头牛血清进行了检查 ,阳性率为 35 .3% ,对上海 6 6 5头牛血清作了检查 ,阳性率为 6 7.7% ,说明这些地区曾流行过赤羽病。同时对澳大利亚当地牛 10 8头进行检查 ,阳性率为 5 5 .5 % ,与国外报道一致。对澳大利亚、加拿大、美国进口牛 173头的检查结果 ,全部阴性。对澳大利亚进口羊 992头的检查结果 ,发现阳性 1头 ,已得到澳方认可。

口蹄疫等5种动物病毒基因芯片检测技术的研究

用分子克隆方法获得口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段 ,用芯片点样仪点样到包被过的玻璃片上 ,制备成检测芯片。提取样品中的RNA ,进行反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果进行扫描检测 ,可同时诊断上述 5种动物传染病 ,此方法不但快速、准确、敏感 ,而且可同时进行多种病毒的检测 。

赤羽病胶体金免疫层析试纸条的研制

采用双抗体夹心免疫层析技术,研制了适合田间快速试验的赤羽病胶体金免疫层析试纸条。纯化赤羽病毒单克隆抗体3A和2C,用柠檬酸钠还原法制备胶体金标记纯化后的单抗作为标记抗体。分别将羊抗鼠IgG和纯化后的单抗包被于NC膜上作为质控带和检测带,以检测被检样品中的赤羽病毒(akabane virus,AKAV)。试验结果表明,所研制的试纸条敏感性较高(为10TCID50),特异性较强,还具有快速、稳定、简便等特点,适合基层动物防疫检疫部门尤其是进出境动物检疫机构进行赤羽病大批量、田间快速初筛,对赤羽病快速诊断具有重要的意义。

赤羽病病毒核衣壳蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原,建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,初步组装成便于现地使用的试剂盒。经对试验条件进行优化,确定最佳抗原包被量为每孔1μg(100μL),样品稀释度为1∶100,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶8 000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用初步研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验法分别对云南省的89份、内蒙古的100份牛血清样本进行了检测,以中和试验为参照,经统计学处理,得出检测临界值分别为0.411和0.303,2种方法的符合率分别为72.7%(56/77)和91.4%(85/93)。试剂盒在37℃保存3 d,对敏感性无明显影响。

赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达

为获得赤羽病病毒 (Akabanevirus ,AKAV )的核蛋白重组抗原 ,根据其基因序列(SmRNA)设计合成了 1对特异性引物 ,对AKAVN基因进行RT PCR扩增 ,产物大小约为 6 96bp ,回收纯化后 ,将其克隆至 pMD18 T质粒载体中 ,经核苷酸序列分析 ,与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的SmRNA基因比较后发现 ,所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达 98.3% ,推测的氨基酸同源性为 97.6 % ,证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体 ,转化TOP10细胞 ,成功地构建了AKAVN基因重组表达载体。经L araboinose诱导表达 ,可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白 ,分子质量约 4 2 .5ku ,其表达产量约占菌体总蛋白的 2 8% ,融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原 。

赤羽病间接ELISA检测方法的建立和标化

应用赤羽病病毒 (AKV)OBE_1株和牛标准阴阳性血清 ,以蔗糖密度梯度离心纯化细胞毒为包被抗原 ,在国内首次建立了检测AKV抗体的间接ELISA方法。该方法与中和试验相关系数 0 .76 14 ,特异性和重复性良好。应用此方法对南京、上海附近奶牛抽样检测 ,阳性率分别为 2 6 .7%和 32 .7%。对澳大利亚、加拿大、美国进口牛 136 0 0头份进行检测 ,全部阴性。

阿卡斑(赤羽病)病毒的分离与初步鉴定

１９９８年７月－８月从上海地区采集的蚊、蠓等标本中分离到１２株病毒，其中有３株电镜观察病毒近似球形，有囊膜，病毒对乙醚、氯仿和胰蛋白酶敏感，对酸、热不敏感，抵抗５－氟脱氧尿苷。经血清－细胞和动物中和试验鉴定，该三株病毒均能被ＡＫＶ病毒高效价免疫血清中和，其余９株病毒未被ＡＫＶ高价免疫血清中和，经初步鉴定证实上述三株病毒为阿卡斑病毒（Ａｋａｂａｎｅ ｖｉｒｕｓ， ＡＫＶ）。阿卡斑病毒在我国的分离尚属首次报道，具有重要的动物流行病学意义。

4种重要虫媒病的核酸液相芯片高通量检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血热病毒（EHDV）、阿卡斑病毒（AKV）、蓝舌病病毒（BTV）和水泡性口炎病毒（VSV）的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中BTV的VP7基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和VSV的NP基因序列进行序列分析,设计针对这些基因的特异性探针并标记生物素,分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与这些病毒相应基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪（Liquichip 200）检测荧光信号建立了以上4种虫媒病的快速液相芯片检测方法。检测结果显示,该方法具有较好的特异性,偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应,而不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度达到50~100个TCID50。本研究建立了可以同时检测鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和水泡性口炎病毒的快速高通量液相芯片技术,为其他类似病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。

阿卡斑病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立和比较试验

为建立阿卡斑病毒抗体检测方法,本研究以纯化的阿卡斑病毒作为包被抗原,以制备的抗阿卡斑病毒的多克隆抗体与待检血清竞争结合抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了阿卡斑病毒竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。通过对60份牛、羊阿卡斑病毒抗体阳性血清和40份阴性血清样品的检测,确定阴阳性样品抑制率(PI)临界值为60%;特异性试验结果显示,该方法对BTV-1、BTV-4、BTV-9、BTV-16、小反刍兽疫、中山病病毒、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、羊痘和O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,标准阳性血清1颐128倍稀释时,检测结果仍为阳性,SNT最低检出为,敏感性高于微量血清中和试验(SNT)检测结果(1颐64);批内和批间变异系数(CV)在0.54%~5.27%和0.3%~9.3%之间,具有较好的可重复性;用该方法与法国IDVET公司的同类试剂盒对85份牛、羊血清样品同时检测,结果显示二者符合率为91.76%,可以替代进口同类产品。本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于阿卡斑病毒抗体检测和流行病学调查。

赤羽病病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种赤羽病病毒(AKAV)的快速检测方法,本研究根据环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计了针对AKAV S基因的特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了AKAV的RT-LAMP方法。特异性和灵敏度试验结果显示,所建立的RT-LAMP检测方法具有良好的特异性,与蓝舌病、牛病毒性腹泻及传染性牛鼻气管炎等病毒无交叉反应,敏感度可达11.5拷贝/μL,采用SYBR Green I染色,肉眼即可判定检测结果。该方法能够简便、快速、灵敏、特异地检测AKAV。

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。

赤羽病研究进展

赤羽病是由阿卡班病毒引起牛、羊等动物流产、死产、死胎、胎儿畸形、以及先天性关节弯曲-积水性无脑综合征的一种虫媒传染病。20世纪30年代该病在澳大利亚羊群中首次暴发。近年来,我国许多省也流行本病,给畜牧业带来巨大损失。文章对该病的病原、流行病学、发病机理、抗原、诊断进行综述,为有效防控赤羽病提供参考。