猪Akirin2基因的定位及其影响IL-1β和IL-6 mRNA表达的研究

本研究旨在研究猪新天然免疫相关基因Akirin2所表达的蛋白在细胞中的定位,以及在受到外源刺激物LPS刺激时,对细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达的影响。本试验用实验室构建好的pEGFP-Akirin2真核表达载体转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),用激光共聚焦显微镜分析Akirin2在SUVEC的定位,并用LPS作为外源刺激物刺激转染Akirin2基因的细胞,荧光实时定量分析细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量的变化。结果表明,Akirin2基因编码的蛋白严格定位于细胞核之内,并在核仁区有明显表达,在LPS刺激后,Akirin2基因对细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量都具有明显上调作用。本研究证实了Akirin2蛋白的亚细胞定位及其对细胞因子表达的影响,为Akirin2基因的作用机制的进一步研究奠定了基础。

猪akirin2基因的克隆与真核表达

Trizol法从猪脾脏中提取总RNA,RT-PCR方法得到猪Akirin2的完整编码区,软件分析猪Akirin2的核酸序列与蛋白序列,进行染色体定位。将Akirin2构建到带有荧光标记的真核表达载体pEGFP-C1中,通过脂质体转染法将pEGFP-Akirin2转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC)中进行表达。结果表明,该序列编码203个氨基酸,猪akirin2基因定位于猪1号染色体,含有4个外显子,猪与牛的Akirin2蛋白高度同源。重组表达质粒pEGFP-Akirin2经双酶切鉴定和测序分析,表明构建成功,pEGFP-Akirin2转染SUVEC细胞后,经荧光检测证实转入的akirin2基因得到表达。研究结果为探讨猪Aki-rin2蛋白在免疫调控中的功能提供了基础数据。

猪akirin2基因的组织表达谱及序列分析

克隆猪的akirin2基因,并对该基因在猪的18个组织中的分布进行研究。猪akirin2基因编码区全长为612 bp(Gen Bank登录号KC140110.1),推测的氨基酸序列包含203个氨基酸,为酸性蛋白。利用BLAST工具对克隆到的猪akirin2基因序列与人、大鼠、小鼠、绵羊和牛的序列进行同源性比较。采用软件对氨基酸序列进行分析,用相关序列的比对结果进行系统进化树分析。组织分布结果显示,猪akirin2基因在脑组织中高表达,在淋巴、睾丸中表达量相对较低,在心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺中几乎检测不到该基因的表达。序列分析结果显示,猪akirin2基因与绵羊和牛的同源性最高,均为96%,与人、小鼠、大鼠的同源性分别为95%、91%、89%。氨基酸序列分析发现,存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28,推测的氨基酸序列的二级结构中含有2个a-螺旋。在重建的系统进化树上,几个不同物种的akirin2蛋白分成3支,结果表明猪akirin2与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近,与鸡的亲缘关系最远。

天府肉羊Akirin2基因的分子克隆、序列分析及组织特异性表达

Akirin2基因是一种核因子,是一个潜在的影响肉质性状的功能候选基因。为了更好地了解Akirin2基因的结构和功能,试验克隆了天府肉羊Akirin2基因cDNA。序列分析结果表明,天府肉羊Akirin2基因cDNA全编码序列（CDs）长579bp,编码192个氨基酸。对天府肉羊和其他物种Akirin2蛋白质序列构建系统进化树,结果发现,天府肉羊Akirin2与牛和绵羊Akirin2亲缘关系较近。RT-qPCR分析结果表明,Akirin2基因在心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腿肌、腹肌和背最长肌中表达,其中,在脾脏、肺脏和肾脏中高表达,在肝脏、心肌、腿肌、腹肌和背最长肌中低表达。mRNA表达结果表明,Akirin2基因在1~12个月天府肉羊背最长肌中的表达水平呈先上升后降低的趋势。Western blotting分析结果显示,仅能在肺脏和骨骼肌中检测到Akirin2蛋白。