基于Akt/mTOR自噬通路介导NLRP3炎症小体失活探讨冲和膏促进糖尿病大鼠溃疡创面愈合的作用机制

目的探讨冲和膏通过蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬通路介导核苷酸结合寡聚酸结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体失活对糖尿病大鼠溃疡创面愈合的作用机制。方法采用高糖高脂饲料喂养、腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)联合皮肤缺损方法构建糖尿病溃疡SD大鼠创面模型36只,将大鼠随机分为模型组、冲和膏组和生长因子组,每组12只。另取12只SD大鼠构建普通创面模型作为空白组。空白组和模型组不进行药物干预,冲和膏组和生长因子组分别外敷冲和膏、生长因子凝胶,观察记录各组大鼠创面愈合情况。给药第7天和第14天分别取材,HE染色观察创面组织病理学改变,并进行成纤维细胞计数;ELISA法检测血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;免疫组化检测创面肉芽组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表达水平;Western Blot法检测创面肉芽组织炎症小体相关蛋白NLRP3、含Caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1、Pro-Caspase-1及Akt/mTOR自噬通路相关蛋白Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表达情况。结果与空白组比较,模型组在第7天和第14天创面病理损伤修复延缓,单位面积成纤维细胞数量较少(P<0.01),炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α水平升高(P<0.01),创面组织中ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、NLRP3表达水平升高(P<0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ以及mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表达水平降低(P<0.01);与模型组比,第7天和第14天冲和膏组和生长因子组病理损伤明显改善,单位面积成纤维细胞数量明显增加(P<0.01),炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α水平明显降低(P<0.01),创面组织中ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、NLRP3表达水平降低(P<0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ以及mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表达水平升高(P<0.01,P<0.05)。结论冲和膏可降低炎症反应,促进成纤维细胞生成,调控Akt/mTOR通路介导NLRP3炎症小体失活,改善创面自噬水平,从而促进糖尿病大鼠溃疡创面愈合。

鬼针草总黄酮调控PI3K/Akt/mTOR自噬通路对高血压大鼠心肌纤维化的影响

目的探讨鬼针草总黄酮(TFB)调控磷脂肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬通路对自发性高血压(SHR)大鼠心肌纤维化(MF)的影响。方法将30只SHR大鼠随机分为5组:SHR组、SHR+坎地沙坦组、SHR+TFB组、SHR+IGF-1(PI3K/Akt/mTOR通路激活剂)组、SHR+TFB+IGF-1组,每组6只。另取6只年龄匹配的雄性WKY大鼠作为WKY大鼠对照组。WKY大鼠对照组和SHR组大鼠予剂量匹配的生理盐水灌胃,SHR+坎地沙坦组予溶于生理盐水的坎地沙坦(40 mg/kg)灌胃,SHR+TFB组予溶于生理盐水的TFB(240 mg/kg)灌胃,SHR+IGF-1组大鼠经侧脑室注射20μg/kg IGF-1,SHR+TFB+IGF-1组大鼠经侧脑室注射20μg/kg IGF-1后予240 mg/kg TFB灌胃,每日1次,连续12周。给药结束后,检测各组大鼠血压、左心室功能指标;HE和Masson染色观察组织病理变化;TUNEL染色观察组织细胞凋亡;试剂盒法测量抗氧化状态;RT-qPCR检测Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(Fibronectin)和波形蛋白(Vimentin)mRNA水平;Western blot检测CollagenⅠ、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、自噬标志蛋白(Beclin-1、LC3B、p62)、PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白水平。结果与SHR组相比,SHR+坎地沙坦组、SHR+TFB组大鼠左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)明显升高,收缩压、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室收缩末期容积(LVESV)、左心室质量指数(LVMI)明显降低,MF程度减轻,CollagenⅠ、α-SMA、Fibronectin、Vimentin表达显著下调,凋亡小体百分比显著降低,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)显著升高,内源性过氧化氢(H_(2)O_(2))、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)显著降低,Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ显著升高,p62表达显著降低,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值显著降低(P<0.05)。与SHR+TFB组相比,SHR+TFB+IGF-1组EF、FS明显降低,收缩压、LVEDD、LVEDV、LVESD、LVESV、LVMI明显升高,MF程度加重,CollagenⅠ、α-SMA、Fibronectin、Vimentin表达显著上调,凋亡小体百分比显著升高,GSH-Px、SOD、Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ显著降低,H_(2)O_(2)、MDA、ROS水平、p62表达及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值显著升高(P<0.05)。结论TFB显著降低SHR大鼠的收缩压,并通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活心肌自噬,降低氧化应激水平和心肌凋亡,进而减轻SHR大鼠的MF。

右美托咪定通过Akt/mTOR自噬通路介导NLRP3炎症小体失活而减轻脓毒症大鼠肠损伤

目的:探讨右美托咪定(DEX)是否通过蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬通路介导核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体失活从而减轻脓毒症大鼠肠损伤。方法:随机数字法对50只大鼠分组:假手术组、模型组、DEX组(0、3和6 h腹腔注射10μg/kg DEX)、DEX+NVP-BEZ235组(在DEX组基础上腹腔注射30 mg/kg NVP-BEZ235)及DEX+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(在DEX组基础上腹腔注射15 mg/kg 3-MA),每组10只。除假手术组外,其余各组盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症大鼠模型,建模后给药。HE染色观察肠道组织形态,对结肠标本进行结肠大体形态损伤指数(CMDI)评分;ELISA检测血清中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;免疫组化检测肠道组织中自噬相关蛋白beclin-1和LC3-II蛋白水平;Western blot检测肠道组织中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1及其前体pro-caspase-1的蛋白水平。结果:模型组大鼠肠道组织完整性被破坏,细胞脱落和炎症浸润现象明显;DEX组大鼠肠道组织完整,仅出现部分细胞脱落和炎症浸润现象;DEX+NVP-BEZ235组和DEX+3-MA组大鼠肠道完整性被破坏,细胞脱落和炎症浸润明显。与假手术组相比,模型组大鼠CMDI评分,血清中IL-1β和TNF-α水平,肠道组织中beclin-1和LC3-II蛋白阳性率,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、NLRP3、ASC和caspase-1/pro-caspase-1蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,DEX组大鼠CMDI评分,血清中IL-1β和TNF-α水平,肠道组织中NLRP3、ASC和caspase-1/pro-caspase-1蛋白水平降低(P<0.05),肠道组织中beclin-1和LC3-II蛋白阳性率及p-Akt/Akt和pmTOR/mTOR蛋白水平升高(P<0.05);与DEX组相比,DEX+NVP-BEZ235组和DEX+3-MA组血清中IL-1β和TNF-α水平及肠道组织中NLRP3、ASC和caspase-1/pro-caspase-1蛋白水平升高(P<0.05),肠道组织中beclin-1和LC3-II蛋白阳性率及p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白水平降低(P<0.05)。结论:DEX能够通过激活Akt/mTOR通路促进自噬而介导NLRP3炎症小体失活,从而减轻脓毒症大鼠肠损伤。

miR-155介导PI3K/Akt/mTOR自噬通路对ApoE^(-/-)小鼠颈动脉粥样硬化斑块的影响

目的探究miR-155对颈部动脉粥样硬化(AS)斑块的影响及其与内磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)自噬通路的关系。方法 40只8周龄雄性ApoE^(-/-)小鼠随机均分为对照组(普通饮食)、模型组(颈动脉套管术+高脂饮食+生理盐水)、miR-155上调组(颈动脉套管术+高脂饮食+miR-155-LV)和miR-155下调组(颈动脉套管术+高脂饮食+miR-155-RNAi-LV)。8周后股动脉取血检测血浆中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平;取右颈动脉以苏木精-伊红(HE)染色方法观察颈动脉斑块生长情况;Western blot方法检测颈动脉中自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ)及PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的表达。结果高脂饮食组小鼠的TC、TG、LDL水平均明显高于对照组(F=7.02~48.81,P均<0.05),但高脂饮食的各组小鼠血脂水平差异无统计学意义(P均>0.05)。与对照组比较,模型组颈动脉管壁增厚、管腔狭窄;与模型组比较,miR-155上调组颈动脉中可见粥样硬化斑块进一步增大,管腔狭窄加重,而miR-155下调组颈动脉中局部斑块形成减小,管腔狭窄减轻。与对照组比较,模型组LC3-Ⅱ蛋白表达减少(t=16.31,P<0.05);与模型组比较,miR-155上调组中LC3-Ⅱ蛋白表达量明显减少(t=4.41,P<0.05),miR-155下调组中LC3-Ⅱ蛋白增加(t=4.52,P<0.05)。与对照组比较,模型组PI3K/Akt/mTOR信号通路中各蛋白表达量明显升高(t=3.30~9.05,P均<0.05),而上调miR-155后,该通路蛋白表达量进一步升高(t=3.12~3.31,P均<0.05);下调miR-155导致该通路蛋白表达明显下降(t=3.31~4.88,P均<0.05)。结论在ApoE^(-/-)小鼠体内,靶向下调miR-155表达可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进自噬,减少颈部AS斑块的形成。

益智仁-乌药药对调控PI3K/Akt/mTOR通路介导细胞自噬保护肾小球足细胞的作用机制研究

目的研究益智仁-乌药药对通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进足细胞自噬治疗糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)的作用。方法60只造模成功的C57BL/KSJ-db/db(以下简称db/db)小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、缬沙坦组、益智仁-乌药药对(低、中、高剂量)组,每组10只;另取10只C57BL/KSJ-db/m(以下简称db/m)小鼠为正常组,正常组和模型组给予生理盐水,治疗组小鼠分别给予相应药物,给药8周后检测小鼠肾脏病理学改变,足细胞自噬体数量、结构及相关蛋白表达。结果与模型组相比,益智仁-乌药药对组可显著减轻糖尿病肾病小鼠肾小球基底膜增厚情况,增加足细胞自噬体数量,显著升高自噬相关蛋白表达(P<0.05),降低PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达(P<0.05)。其中益智仁-乌药药对高剂量组各指标改善优于益智仁-乌药低、中剂量组。结论益智仁-乌药药对通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活,提高足细胞自噬水平,减轻足细胞损伤,发挥治疗糖尿病肾病的作用。

异莲心碱通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬

目的:探讨异莲心碱(Iso)通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法:用10、20和40μmol/L的Iso处理结肠癌SW480细胞,CCK-8法、流式细胞术和WB法分别检测Iso对细胞增殖活力、凋亡和自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表达的影响。然后,用20μmol/L的Iso和25μmol/L的PI3K激活剂740 Y-P分别处理SW480细胞,将细胞分为对照组、740 Y-P组、Iso组和Iso+740 Y-P组,流式细胞术、WB法检测Iso和740 Y-P对各组细胞凋亡及细胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表达的影响。结果:10、20和40μmol/L的Iso处理后,SW480细胞增殖活力均显著下降(均P<0.05),细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著上调(均P<0.05),p26蛋白表达显著下调(P<0.05)。Iso和740 Y-P处理后,与对照组相比,740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05);Iso组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与740 Y-P组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与Iso组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05)。结论:Iso通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制结肠癌SW480细胞增殖并诱导细胞凋亡和自噬。

基于Akt/mTOR信号通路探讨补肾活血方对去卵巢大鼠软骨细胞自噬的影响

目的:研究补肾活血方是否可以通过调控Akt/mTOR信号通路促进去卵巢大鼠软骨细胞自噬反应来保护关节软骨。方法:选取30只SPF级12周龄雌性SD大鼠,体重(247.0±7.0)g,先随机选择6只为空白对照组,剩余大鼠采用卵巢切除术结合右膝关节腔注射碘乙酸钠(monosodium iodoacetate,MIA)建立绝经后膝骨关节炎模型,随机分为模型组、BSHXR-L组、BSHXR-M组、BSHXR-H组,每组6只。运用肉眼观察评分、番红O-固绿染色、免疫组化等方法明确补肾活血方对大鼠关节软骨损伤的保护作用,Western-blot检测自噬相关蛋白的表达,qPCR检测Akt、mTOR及下游自噬基因的相对表达。结果:造模后BSHXR(L、M、H)各组均可减轻软骨组织形态学损伤,免疫组化示Collagen-Ⅱ、Aggrecan表达逐渐升高,基质金属蛋白酶-13(matrix metallopriteinase-13,MMP-13)表达逐渐降低,其中BSHXR-M组和BSHXR-H组与模型组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果示BSHXR(L、M、H)各组自噬通路蛋白p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR受到抑制,下游蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表达逐渐升高,而p62逐渐降低,呈剂量效应。qPCR结果示BSHXR(L、M、H)各组均可促进Beclin-1、LC3ⅡmRNA的相对表达,抑制p62、Akt、mTOR mRNA的相对表达,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾活血方可以通过抑制Akt/mTOR信号通路增强软骨细胞自噬反应,进而发挥保护软骨的作用。

不同强度运动抑制糖尿病大鼠肾脏PI3K/AKT/mTOR信号通路改善自噬的比较

背景:2型糖尿病损害肾功能。研究表明运动干预可以保护肾脏;鸢尾素可以通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路恢复自噬,保护糖尿病肾病患者的肾功能。目的:探讨运动能否通过抑制肾脏磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路过度激活来恢复自噬,改善肾损伤,以及分析不同方式运动产生影响的差异。方法:将6周龄的SD大鼠随机分为空白对照组(正常大鼠)和糖尿病组,其中糖尿病组大鼠经过高脂高糖喂养加腹腔注射低剂量1%链脲佐菌素(30 mg/kg)建立2型糖尿病模型。造模成功后再将糖尿病组大鼠随机分成糖尿病模型组、中强度持续运动组和高强度间歇运动组。两个运动组大鼠分别进行8周不同强度运动干预。取材后采用葡萄糖氧化酶法检测大鼠空腹血糖,使用试剂盒检测糖化血红蛋白水平,Elisa法检测血清胰岛素浓度,计算胰岛素抵抗指数,RT-PCR检测肾组织磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B、雷帕霉素靶蛋白、Beclin-1、podocin、nephrin的基因表达量,Western Blot检测肾组织雷帕霉素靶蛋白及自噬标记蛋白LC3-1、LC3-2、Beclin-1的蛋白表达量。结果与结论:①2型糖尿病大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平极显著性升高,胰岛素抵抗水平显著上升,胰岛素水平显著下降;两种运动均能使2型糖尿病大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平极显著下降,胰岛素抵抗水平显著下降,胰岛素水平显著上升;与中强度持续运动组相比,高强度间歇运动组胰岛素水平显著上升。②2型糖尿病大鼠podocin、nephrin基因表达量显著降低;两种不同形式运动均能显著提高其表达;与高强度间歇运动组相比,中等强度持续性运动组足细胞相关蛋白基因表达有进一步上升趋势,但无显著性差异。③2型糖尿病大鼠肾组织磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B、mTORC1的mRNA及蛋白的表达量显著增加,自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-2表达量以及LC3-2/LC3-1显著降低;两种不同形式运动均能使肾组织磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B、mTORC1的mRNA及雷帕霉素靶蛋白蛋白的表达量显著降低,自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-2以及LC3-2/LC3-1显著升高;与中等强度持续性运动组相比,高强度间歇运动的磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B、mTORC1的mRNA及雷帕霉素靶蛋白的蛋白表达量有进一步下降的趋势,Beclin-1、LC3-2以及LC3-2/LC3-1有进一步升高的趋势,但仅Beclin-1有显著性差异。④结果说明2型糖尿病肾脏足细胞损伤,自噬受到抑制,与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/mTORC1信号通路被异常激活密切相关。高强度间歇运动和中等强度持续性运动可以保护糖尿病肾脏,减少足细胞损伤,促进自噬恢复,这可能与运动抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路过度激活有关。与中等强度持续性运动相比,高强度间歇运动恢复自噬的效果呈更优趋势,但足细胞蛋白表达稍有下降。

索拉非尼基于Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路介导细胞自噬在肝细胞癌中产生耐药机制研究进展

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,它的形成是一个复杂的过程,其具体形成机制尚不明确,由于大多数HCC患者被诊断出来时已是晚期,通常已丧失良好的手术时机。而靶向药物的出现给当前HCC患者带来了新的希望,同时还可作为术后治疗措施,在HCC中发挥着巨大的作用。索拉非尼是第一个被用于治疗HCC的靶向药物,它可抑制肝肿瘤组织血管生成和细胞增殖,可诱导肝肿瘤细胞凋亡,进而提高部分肝癌患者的生存率。但据目前研究显示,有50%~60%HCC经治患者对该药物出现了敏感性下降。主要是由于索拉非尼使用后会抑制体内相关信号通路,从而致使耐药的发生,故进一步探索索拉非尼耐药机制,使其逆转索拉非尼耐药对于改善肝癌治疗的预后具有极其重要的临床价值。近些年来,许多学者致力研究索拉非尼通过Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路介导细胞自噬与耐药性的产生有着密切联系。并探讨其耐药分子机制,使该领域获得了巨大的发展。因此,本篇文章主要从Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路展开,探讨其与细胞自噬之间的关系以及介导的耐药机制,为索拉非尼治疗肝癌产生耐药性提供可靠的科学理论依据。

葫芦素B通过AKT/mTOR和MAPK信号通路诱导非小细胞肺癌细胞自噬

目的:观察葫芦素B(Cucurbitacin B,CuB)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞自噬的影响,探讨其可能的机制。方法:应用CCK-8法测定不同浓度CuB对A549细胞及H1299细胞增殖能力的影响。应用丹酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色,荧光显微镜下观察细胞自噬,应用透射电镜观察自噬小体和自噬溶酶体。另外,应用自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)进行转染,使用共聚焦显微镜观察药物处理后的自噬流变化。Western blot方法检测自噬相关标志物LC3II/I、p62及Beclin-1的表达水平变化。应用Western blot考察AKT、mTOR、ERK、p38、JNK蛋白及其磷酸化蛋白表达水平变化。结果:CuB呈剂量依赖抑制A549及H1299细胞增殖。MDC染色荧光显微镜下观察,药物处理组可见明显绿色致密斑点;药物处理48 h后透射电镜观察可见自噬溶酶体;mRFP-GFP-LC3转染A549及H1299细胞后显示CuB组红色荧光增加,提示自噬流增加;0.04μmol/L的CuB处理A549及1299细胞48 h后,LC3II/I及Beclin-1的蛋白表达增加,p62表达水平降低,AKT及mTOR蛋白磷酸化水平表达降低,ERK、JNK、p38 MAPK磷酸化蛋白水平升高。结论:本研究首次阐明了CuB在非小细胞肺癌中具有诱导自噬的能力,这种作用可能与抑制AKT/mTOR、激活MAPK信号通路有关。

姜黄素调节PI3K/AKT/mTOR信号通路对LPS诱导的角膜基质细胞自噬的影响

目的:探讨姜黄素调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对LPS诱导的角膜基质细胞自噬的影响。方法:小鼠角膜基质细胞分为对照组、LPS组(1μg/μl LPS)、L-Cur组(15μmol/L姜黄素)、M-Cur组(30μmol/L姜黄素)、H-Cur组(50μmol/L姜黄素)、H-Cur+740Y-P组(50μmol/L姜黄素+10μmol/L PI3K激活剂740Y-P);MTT检测姜黄素对角膜基质细胞毒性和细胞活力的影响;ELISA检测角膜基质细胞炎症因子水平;免疫荧光染色检测小鼠角膜基质细胞Beclin1、LC3水平;Western blot检测角膜基质细胞自噬相关蛋白及通路相关蛋白表达。结果:0~90μmol/L姜黄素对角膜基质细胞无明显毒性。与对照组相比,LPS组A570nm、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平显著降低(P<0.05),IL-6、IL-8水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,L-Cur组、M-Cur组、H-Cur组A570 nm、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平依次显著升高(P<0.05),IL-6、IL-8水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平依次显著降低(P<0.05);H-Cur+740Y-P消除了姜黄素对角膜基质细胞的有利作用。结论:姜黄素可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进LPS诱导的角膜基质细胞自噬。

胡桃醌通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬的研究

目的:研究胡桃醌通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬,发挥其抗肺癌作用的机制。方法:MTT法检测胡桃醌对A549细胞存活率的影响。透射电镜和细胞自噬染色检测试剂盒(MDC)观察胡桃醌诱导A549细胞自噬。蛋白免疫印迹法检测自噬标志蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ和LC3I蛋白和自噬经典通路Akt/mTOR/p70S6K相关蛋白的表达水平。RT-PCR法检测A549细胞中Beclin-1和LC3ⅡmRNA表达水平。结果:MTT结果表明胡桃醌抑制A549细胞增殖,IC 50=10μmol/L;透射电镜和MDC实验发现胡桃醌可以诱导A549细胞产生自噬;与对照组相比,胡桃醌可以显著增加Beclin-1蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LC3I比值和Beclin-1、LC3ⅡmRNA表达水平(P<0.05,P<0.01);胡桃醌干预后,与对照组相比,Akt、mTOR和p70S6K蛋白的表达水平基本不变,但Akt、mTOR和p70S6K磷酸化蛋白的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:胡桃醌可能通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬。

基于Akt/mTOR信号通路探讨洋地黄毒苷调控甲状腺滤泡上皮细胞自噬与凋亡的机制

目的探究洋地黄毒苷对脂多糖刺激下的人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-roi3-1凋亡与自噬的影响及其作用机制。方法①将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷低剂量组、脂多糖+洋地黄毒苷中剂量组及脂多糖+洋地黄毒苷高剂量组,各组进行对应处理后,CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色观察各组细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70S6K蛋白表达情况。②将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷组、脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组,各组进行对应处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR及p70S6K蛋白表达情况。结果①与脂多糖组比较,脂多糖+洋地黄毒苷各组的细胞活力均明显升高(P均<0.05);LC3荧光染色强度随洋地黄毒苷剂量增加逐渐增强,细胞凋亡率均明显降低(P均<0.05);细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。②与脂多糖组比较,脂多糖+洋地黄毒苷组细胞凋亡率明显降低(P<0.05);细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。与脂多糖+洋地黄毒苷组比较,脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。结论洋地黄毒苷能够促进脂多糖刺激下Nthy-roi3-1细胞自噬,抑制细胞凋亡,该作用可能与其抑制Akt/mTOR信号通路的激活有关。

PPVI通过调节PI3K/AKT/mTOR通路对食管癌细胞ECA-109凋亡和自噬的影响

目的:探讨中药提取物重楼皂苷VI(PPVI)通过调节PI3K/AKT/mTOR通路对食管癌细胞凋亡和自噬的影响。方法:将对数生长期ECA-109细胞分为对照组(不进行处理)、PPVI低剂量组(添加2.5mg/L的PPVI处理)、PPVI中剂量组(添加5.0mg/L的PPVI处理)、PPVI高剂量组(添加7.5mg/L的PPVI处理)、IGF-1组(添加10nmol/mL的IGF-1处理)、IGF-1+PPVI组(添加10nmol/mL的IGF-1和7.5mg/L的PPVI处理),CCK-8检测ECA-109细胞活力,Transwell检测ECA-109细胞迁移,流式细胞术检测ECA-109细胞凋亡,Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路和自噬相关蛋白。结果:与对照组相比,PPVI低剂量组、PPVI中剂量组、PPVI高剂量组中ECA-109细胞活力、迁移能力明显降低,凋亡能力明显升高(P<0.001),而IGF-1组ECA-109细胞活力、迁移能力显著升高,凋亡能力明显降低(P<0.001);与PPVI高剂量组相比,IGF-1+PPVI组的ECA-109细胞活力、迁移能力明显升高,凋亡能力明显降低(P<0.001);与对照组相比,PPVI低剂量组、PPVI中剂量组、PPVI高剂量组ECA-109细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白水平明显降低,p62蛋白水平明显升高(P<0.001),而IGF-1组ECA-109细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白水平显著升高,p62蛋白水平明显降低(P<0.001);与PPVI高剂量组相比,IGF-1+PPVI组的ECA-109细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白水平明显升高,p62蛋白水平明显降低(P<0.001)。结论:PPVI可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导ECA-109细胞凋亡和自噬,抑制ECA-109细胞活力和迁移。

丹酚酸B通过PI3K/AKT/mTOR信号通路对衰老巨噬细胞生物学功能的影响研究

目的:分析丹酚酸B通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/苏氨酸蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶标(mTOR)信号通路对衰老巨噬细胞生物学功能的影响。方法:以小鼠骨髓巨噬细胞为研究对象,利用3%过氧化氢溶液建立巨噬细胞衰老模型。实验分为对照组、衰老组和丹酚酸B组,对照组为未衰老的巨噬细胞,衰老组为衰老的巨噬细胞,丹酚酸B组为经丹酚酸B处理衰老的巨噬细胞,干预浓度分别为10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L。以细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞活性,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测炎症因子表达,免疫双荧光法检测衰老巨噬细胞向M1和M2型极化情况,蛋白质印迹法(WB)检测PI3K、AKT、mTOR表达。结果:从0 h至72 h,各组检测到的吸光度(OD)值逐渐增加。在72 h时,衰老组巨噬细胞增殖活力低于对照组(P<0.05)。与衰老组比较,10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L丹酚酸B组巨噬细胞增殖活力均更高(P<0.05)。100μmol/L、50μmol/L丹酚酸B组巨噬细胞增殖活力均高于10μmol/L丹酚酸B组(P<0.05)。100μmol/L丹酚酸B组巨噬细胞增殖活力虽低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,衰老组和100μmol/L丹酚酸B组白细胞介素(IL)-1β、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)相对表达量均上升(P<0.05),IL-4、IL-10、精细氨酸1(Arg1)相对表达量均下降(P<0.05)。与衰老组比较,100μmol/L丹酚酸B组IL-1β、iNOS、TNF-α相对表达量均下降(P<0.05),IL-4、IL-10、Arg1相对表达量均上升(P<0.05)。与衰老组比较,100μmol/L丹酚酸B组CD206表达上调,CD86表达下调。与对照组比较,衰老组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量均上升(P<0.05)。与衰老组比较,100μmol/L丹酚酸B组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量均下降(P<0.05)。100μmol/L丹酚酸B组中p-PI3K表达量高于对照组(P<0.05),而p-AKT、p-mTOR表达量与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:丹酚酸B可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路增强衰老巨噬细胞增殖活力并促进其向M2型极化。

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨细胞自噬对激素性股骨头缺血性坏死的作用机制研究进展

激素性股骨头缺血性坏死是长期或过量使用糖皮质激素引起的一种非创伤性疾病。现代研究发现,自噬作为一种细胞内调节机制,其与激素性股骨头缺血性坏死之间存在一定的相关性。而PI3K/Akt/mTOR信号通路是干预细胞自噬的关键环节,对细胞代谢平衡具有重要的病理生理作用。明确自噬在该通路的调控下对激素性股骨头缺血性坏死致病过程的影响,将有助于从分子水平认识该病,并期望通过靶向调节自噬水平,达到延缓激素性股骨头缺血性坏死进程的目的。因此,本文就PI3K/Akt/mTOR信号通路、细胞自噬及激素性股骨头缺血性坏死三者之间的联系进行综述,以期为临床靶向治疗激素性股骨头缺血性坏死提供新的视角及理论依据。

lncRNA NEAT1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节自噬影响膜性肾病的进展

目的 探讨长链非编码RNA核富集转录本1(lncRNA NEAT1)对膜性肾病(MN)中自噬的影响及其机制。方法 利用白蛋白诱导HK-2细胞构建体外MN模型,将HK-2细胞分为5组:对照组、模型组、LY294002(PI3K抑制剂)组、OV-NEAT1(NEAT1过表达)组和OV-NEAT1+LY294002组。CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,qRT-PCR和Western blot检测自噬和PI3K/Akt/mTOR通路相关mRNA和蛋白的表达水平。结果 与对照组相比,模型组细胞增殖能力及细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达水平显著降低(均P<0.01),细胞凋亡率及细胞中LC3-Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR mRNA和p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著升高(均P<0.01);与模型组相比,OV-NEAT1组细胞增殖能力、细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA和LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达水平显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率及细胞中LC3-Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR mRNA和p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著升高(均P<0.01),LY294002组趋势相反;与LY294002组相比,OV-NEAT1+LY294002组细胞增殖能力及细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA和LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达水平显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率及细胞中LC3-Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR mRNA和p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。结论lncRNA NEAT1能够抑制白蛋白诱导的HK-2细胞的自噬,其机制可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活有关。

骨炎消方通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对骨关节炎细胞自噬的影响

目的通过PI3K/Akt/mTOR信号通路探究骨炎消方对骨关节细胞自噬调节的作用机制。方法构建软骨细胞炎症模型,将细胞随机分为6组:空白组(兔软骨细胞+完全培养基)、模型组(兔软骨细胞+10μg/mL LPS培养基)、阳性组(兔软骨细胞+LPS+D-氨基葡萄糖150μmol/L)、骨炎消低剂量组(兔软骨细胞+LPS+1μg/mL骨炎消)、骨炎消中剂量组(兔软骨细胞+LPS+10μg/mL骨炎消)、骨炎消高剂量组(兔软骨细胞+LPS+100μg/mL骨炎消)。CCK-8法检测细胞增殖;酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中自噬因子ATG5、ATG12水平;实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞PI3K、Akt、mTOR基因相对表达量;Western blotting检测PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1蛋白相对表达量。结果空白组、模型组及不同浓度组软骨细胞存活率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较,模型组、阳性组及骨炎消高、中、低组软骨细胞ATG5和ATG12水平均降低(P<0.05);与模型组比较,阳性组和骨炎消高、中、低组软骨细胞ATG5和ATG12水平均升高(P<0.05)。与模型组相比,骨炎消高、中、低组软骨细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA相对表达量均降低(P<0.05)。与空白组相比,模型组软骨细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量均升高(P<0.05),Beclin-1蛋白相对表达量降低(P<0.05);与模型组比较,阳性组和骨炎消高、中剂量组的PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达降低(P<0.05),阳性组和骨炎消高、中、低组Beclin-1蛋白相对表达量升高(P<0.05)。结论骨炎消方可有效防治骨关节炎,其作用机制可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,引起自噬在一定程度上调,促进软骨细胞增殖分化,从而减缓骨关节炎的进展。

茯苓酸调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进结直肠癌细胞凋亡的机制研究

目的 研究茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢及细胞凋亡的调控作用。方法 通过细胞活性测定(Cell Counting Kit-8,CCK8)、克隆形成等实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞增殖与细胞活性的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞凋亡的影响;使用细胞氧气消耗率和细胞外酸化率测定仪器及细胞葡萄糖代谢水平测定试剂盒检测茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢的影响;通过蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)实验验证凋亡、糖酵解、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶(AKT Serine/Threonine Kinase 1,AKT)/雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)通路相关蛋白表达情况。结果 茯苓酸能够有效抑制结直肠癌细胞增殖与细胞活性,并能够通过抑制其糖酵解水平促进其细胞凋亡,同时显著抑制PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平。结论 茯苓酸可通过调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进CRC细胞凋亡,可作为未来结直肠癌代谢靶向治疗的潜在药物。

阿江榄仁酸由AMPK/mTOR/HO-1信号通路调控自噬对糖尿病视网膜病变影响

目的探讨阿江榄仁酸(arjunolic acid,AA)对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜细胞自噬及AMPK/mTOR/HO-1信号通路的影响。方法以健康SD大鼠为研究对象,构建链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型,随机分为对照组(Con)组、模型(STZ)组、AA低剂量(AAL,10 mg/kg)组和AA高剂量(AAH,10 mg/kg)组。连续给药10周后,HE染色检测视网膜组织病理结构;qRT-PCR检测视网膜组织白介素(IL)-1β、IL-6和线粒体丙酮酸转运载体(MPC)-1的mRNA表达;二氢乙锭(DHE)染色评估视网膜组织ROS产生;Western blot检测自噬和AMPK/mTOR/HO-1信号通路相关蛋白表达。结果与Con组比较,STZ组大鼠视网膜出现肿胀和空泡样变化等病理变化,中央视网膜ONL层厚度和细胞核计数明显降低(P<0.01);IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA水平显著增高(P<0.05);视网膜外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)中ROS产生增加(P<0.01);LC3II/I比率、HO-1和p-AMPK/AMPK蛋白表达显著降低,p62和p-mTOR/mTOR表达升高(P<0.01)。与STZ组比较,AAL和AAH组大鼠视网膜ONL厚度和细胞核计数逐渐升高,结构相对规整(P<0.05);AAH组IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达明显降低(P<0.05);视网膜ONL、INL和GCL中ROS产生逐渐降低(P<0.01);LC3II/I比率、p-AMPK/AMPK和HO-1表达逐渐升高,p62和p-mTOR/mTOR表达逐渐降低(P<0.01)。结论阿江榄仁酸可能是治疗DR的候选药物,可能机制为通过AMPK/mTOR/HO-1调节的自噬途径保护视网膜细胞免受STZ诱导的氧化应激和炎症损伤。