抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报

以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础。结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体。获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L。经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中。

β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体抑制大豆抗原蛋白的表达

为幼龄动物提供优质的大豆饲料,同时有效抑制α＇亚基和β亚基基因表达量,根据dsRNAi原理,以α＇亚基基因RNAi重组植物表达载体pCAMBIA3301-PFNZ-BADH为基础,构建以BADH安全标记为筛选标记的α＇亚基和β亚基基因双价RNAi植物表达载体。用根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节,并对再生植株进行分子生物学检测。结果表明：成功构建β-伴大豆球蛋白α＇亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体,并获得大豆转基因植株。T1转基因大豆植株经PCR检测得到11株阳性转化株,经Southern杂交检测证明构建的双价植物表达载体已经以1-2个拷贝整合到大豆基因组中,实时荧光定量PCR检测表明β-伴大豆球蛋白α＇亚基和β亚基基因的表达被明显抑制。

乙型肝炎病毒X基因蛋白诱导人类白细胞抗原DR表达

乙型肝炎病毒(HBV)所致的肝细胞坏死,被认为是与人类白细胞抗原(HLA)有关的MHC限制的T细胞为主的免疫应答的结果。本研究证实,转染HBV基因组或X基因后的人肝癌细胞系可诱导HLAⅡ(即HLA DR)表达。核转录及RNA杂交分析提示表达X基因的细胞其HLA DR mRNA水平增加,X蛋白增加该基因的转录。氯霉索乙酰基转移酶(CAT)基因分析进一步提示,X蛋白通过作用于HLA DR基因上游的调节序列诱导HLA DR表达。结果表明:X蛋白可能通过调节HLA DR表达参与HBV感染的免疫发病机理。

人T-bet和HBV-L共表达质粒的构建及体外表达

目的构建人转录因子T-bet基因与乙肝病毒表面抗原大蛋白全长基因(hepatitis B virus surface antigen large protein,HBV-L)的共表达载体,并检测其在体外的表达。方法利用PCR及基因重组技术,以人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的cDNA为模板,扩增获得人T-bet全长基因,以含有HBV-L的质粒pcDNA3.1-HBV-L为模板,扩增获得HBV-L基因,将上述2个基因克隆至真核表达质粒p IRES中,获得共表达质粒p IRES-T-bet-HBV-L。将该质粒转染293T细胞,经RT-PCR、ELISA和细胞免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。结果限制性酶谱分析及测序证实重组质粒p IRES-T-bet-HBV-L构建成功;该质粒在体外转染293T细胞后,可表达T-bet与HBV-L两者的mRNA;细胞免疫荧光试验和ELISA检测结果证实,该质粒转染293T细胞后可表达T-bet和HBV-L蛋白。结论成功构建了共表达质粒pIRES-T-bet-HBV-L,该质粒能在293T细胞中表达。

多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)与HBV转录后调节元件(HPRE)结合抑制HBV表面抗原的基因表达

采用RT-PCR验证PTB与HPRE在体外的特异性结合。用HepG2.2.15细胞系、HBs-HPRE瞬时转染Hela细胞探讨PTB对HBV基因表达的影响。结果显示PTB能与HPRE特异性地结合。功能性研究证明PTB可以抑制HepG2.2.15细胞的HBsAg表达量,并呈浓度依赖性。由HPRE引起的HBsAg表达的增加也能被PTB所抑制。实验数据证明PTB通过与HPRE相互作用抑制HBsAg的基因表达。

转乙肝抗原蛋白基因苜蓿毒理学安全性的研究

目的对转乙肝抗原蛋白基因苜蓿进行安全性评价试验研究,为其进一步研发提供依据。方法采用急性毒性试验、遗传毒性试验(包括V79细胞基因突变试验、Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验)对转乙肝抗原蛋白基因苜蓿进行系统的安全性研究。结果转乙肝抗原蛋白基因苜蓿最大耐受剂量>10.0 g.kg?1,属实际无毒级。V79细胞基因突变试验、Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。结论转乙肝抗原蛋白基因苜蓿属实际无毒类物质,在本试验条件下无致基因突变和染色体畸变作用。

转乙肝抗原蛋白基因苜蓿胚胎毒性和致畸性研究

目的采用动物实验对转乙肝抗原蛋白基因苜蓿（ATHAPG）的大鼠胚胎毒性和致畸性进行研究，为探索ATHAPG对人体健康影响和制订每日允许摄入量提供依据。方法将受孕sD大鼠随机分为40、200和1000mg／kg3个剂量组及阴性对照组（蒸馏水）。每组12～14只孕鼠，于孕期7～16d每天给受试动物灌胃1次，妊娠第20天处死，检查孕鼠妊娠与胎鼠畸形情况。结果3个剂量组的孕鼠生殖能力、体熏及胎鼠体重、外观发育、骨骼和内脏畸形率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论在该试验条件下，ATHAPG在40～1000mg／kg剂量范围对大鼠无明显的母体毒性、胚胎毒性和致畸性。