碱裂解提取质粒DNA的改进方法

实验室中常用的质粒提取方法是碱裂解法.一般碱裂解法提取质粒相对耗时长,而且需要冰浴,条件较为严格,本文尝试对碱裂解法进行改进,即在控制菌体量的前提下连续加入溶液Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,进行质粒提取,简化了操作步骤,缩短了实验时间(由150min左右缩短为110min以内),质粒收率和质量不变.

一种经济高效的用Silica提取纯化质粒DNA的方法

目的:为了达到批量提取质粒DNA的目的,在多次实验的基础上,建立一种经济、高效的质粒提取方法。方法:以pUC18、pET28b、pCAMBIA1304等3种质粒为材料,分别采用silica法和碱裂解法提取质粒DNA,通过质粒DNA浓度的紫外分光光度法定量测定、电泳分析和Hind Ⅲ酶切鉴定,对两种质粒提取方法的效果进行了比较与评价;对silica法进行了改进和优化,进行大批量重组子的提取和验证。结果:silica法和碱裂解法提取质粒DNA效果相当,都可进行后续实验,但silica法具有经济、高效、无毒的优势。结论:silica法是一种简单、经济、高效的质粒提取方法,可用于批量质粒DNA提取。

HIV-GAG质粒DNA疫苗的纯化工艺

采用中空纤维超滤浓缩、离子交换介质和复合模式凝胶过滤介质纯化获得了HIV-GAG药用级质粒DNA疫苗,并对菌体培养、菌体裂解、粗提分离和柱层析等环节进行研究.实验结果表明,产品基本符合药用级的质粒DNA要求.

碱裂解法提取质粒DNA的研究

目的对碱裂解法提取质粒DNA中主要试剂的作用进行研究。方法采用不同的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ分别进行质粒DNA的提取。结果方法3得到质粒DNA的量明显偏少,方法4得到的质粒DNA含蛋白质较多。结论溶液Ⅰ对实验结果影响不大,溶液Ⅱ中的NaOH关系到所提取质粒DNA量的多少,溶液Ⅲ中的醋酸钾是蛋白质能否去除的一个重要因素。

质粒DNA提取方法的探讨

本实验利用构建好的含有抗病虫基因的大肠杆菌的质粒,采用了碱裂解法、煮沸法、SDS法进行提取。在比较这些方法的同时,进一步对它们进行优化,从而使其得到完善。结果表明:在小质粒中,三种方法中碱裂解法所得到的DNA制品其浓度和纯度都明显高于其它两种方法。

小量提取质粒DNA的简易方法

碱裂解法是目前最为广泛应用的质粒DNA的提取方法,本人利用0.9%NaC l溶液代替常规方法中的溶液Ⅰ,并缩短了一些步骤的反应时间,既达到了快速、简便提取质粒DNA的目的,又可以满足分子生物学后续实验的要求.

改进溶液Ⅱ配方可提高质粒DNA提取的质量及得率

目的通过改进溶液Ⅱ配方,消除质粒DNA提取中的不可逆变性条带,提高质粒DNA提取的质量与得率。方法取氨苄LB液体培养液中培养好的DH5α(pCDNA3),以NaOH系列梯度浓度/甘氨酸-NaOH缓冲液体系配制溶液Ⅱ,依据文献提供的方法,小量提取制备质粒DNA,以凝胶电泳、紫外分光光度计及酶切验证提取效果。结果在NaOH浓度为0.10mol/L下,不可逆变性条带基本得到消除,超螺旋DNA的提取纯度和得率均得到明显提高。结论改变溶液Ⅱ的碱性条件,可以制备高质量的质粒DNA。

重组质粒pRSET DNA提取方法的探究

通过两种从大肠杆菌中提取重组质粒pRSET DNA不同方法的比较,寻找提取重组质粒pRSET DNA的切实可行的方法.将含有目的质粒的菌株分别采用SDS碱裂解法和煮沸法进行质粒DNA小量提取,采用DU800核酸蛋白分析仪测定质粒DNA的产量及纯度.结果SDS碱裂解法获得质粒DNA产量为5.61μg/ml菌液,A260/280=1.95;煮沸法获得质粒DNA产量为4.36μg/ml菌液,A260/280=1.78.与煮沸法相比,SDS碱裂解法获得质粒产量更多,纯度更高,更适合分子生物学常规实验的要求.

应用碱性抽提法和羟基磷灰石柱层析法提纯质粒DNA

用碱性抽提法和羟基磷灰石柱层析法,加以改进,总结出一套简便易行、低花费的质粒提纯方法。此法适用于一般条件试验室,可进行质粒的批量制备,所提纯质粒经限制性内切酶消解和转化试验,其产量(900μg/500 ml)、纯度和生物学活性均可满足重组DNA的需要。

碱裂解法提取P.ananatis变异体质粒DNA改良研究

[目的]对常规碱裂解法进行改进。[方法]分别改变溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及无水乙醇的反应时间,少量提取质粒DNA。根据产率和纯度,得出各溶液的最佳反应时间,以紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳结果验证提取效果。[结果]将常规碱裂法中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及无水乙醇的反应时间由原来的5、5、5、15 min分别缩短至0、1、1、5 min,纯度达1.8~1.9,产率达180.0~248.0μg/ml。[结论]改良法提取质粒DNA,总提取时间缩短了23 min。

一种高效安全提取质粒DNA方法的建立

在碱裂解法提取质粒DNA的基础上做了改进,将NaOH浓度从0.20mol/L降低为0.10mol/L,使得超螺旋DNA的得率进一步提高.采用silica法纯化质粒DNA,避免了使用有毒性和挥发性气味的饱和酚和氯仿,使得操作更安全简单.电泳结果表明,提取的质粒DNA质量好,得率高,并且可以直接进行下一步的酶切、连接及转化等实验.同时,该方法中使用的硅胶可以回收再生进行重复利用,节省了实验费用.

抑制素质粒的提取与纯化研究

[目的]为抑制素质粒的大量提取与纯化寻找一种成本低的方法。[方法]采用碱裂解法与DEAE-纤维柱层析法提取与纯化抑制素质粒DNA,用分光光度法测定其浓度和纯度。[结果]抑制素质粒DNA的等电点为2.0～2.5,低于大部分蛋白质。pH值为8.0时,抑制素质粒DNA带负电荷,且电荷数量与RNA和蛋白质不同。用紫外分光光度计测定的柱层析后洗脱峰1、2、3在260和280 nm波长处的吸光度值分别为3.01和2.9、0.95和0.51、0.84和0.76,其OD260 nm/OD280 nm分别为1.04、1.86和1.10。3 mol/LNaCl的洗脱峰1大部分是蛋白质,0.6 mol/LNaCl的洗脱峰2是浓度为93.0 ng/ml的抑制素质粒DNA,3 mol/LNaCl的洗脱峰3是杂质。[结论]利用碱裂解法能从大肠杆菌细胞中分离出抑制素质粒DNA,DEAE-纤维柱层析法纯化的抑制素质粒DNA达到了要求的纯度。

基因治疗用质粒DNA生产面临的问题及研究进展

基因治疗已成为21世纪一些重大疾病的有效治疗策略,目前携带治疗基因的重组质粒已作为基因药物进入临床研究。对用于基因治疗的生物制品的生产与质量控制都有相当严格的要求。虽然已建立大规模符合药学规格的质粒DNA生产工艺,能满足临床需求,但在这些生产工艺中还存在一些难以克服的瓶颈,如:载体构建、细胞裂解、细菌染色体DNA去除、细菌内毒素去除、生产过程中质量控制等。就近年来大规模生产临床用质粒DNA遇到的相关问题及解决方案作一综述。