不同毛色羊驼皮肤中Agouti和PMEL基因表达与毛纤维中黑色素含量的相关性研究

为研究羊驼(Vicugna pacos)皮肤中控制黑色素生成的鼠灰色基因(Agouti Signaling gene,Agouti)和前黑素小体蛋白基因(premelanosome protein gene,PMEL)的表达量与毛纤维中黑色素含量的相关性,试验从不同毛色羊驼皮肤差异表达基因中筛选主要毛色相关基因。用紫外分光光度法测定白色、棕色和黑色羊驼毛纤维中的黑色素含量,并用实时定量PCR(qRT-PCR)法和Fisher法对Agouti与PMEL的相对表达量与毛纤维中黑色素的含量的相关性进行分析。结果显示,23个毛色基因在白色和黑色羊驼皮肤中呈差异表达,白色和褐色皮肤中Agouti的mRNA表达显著高于黑色皮肤中Agouti的表达;PMEL在羊驼黑色皮肤中的表达高于棕色皮肤和白色皮肤中的表达(P<0.05)。Agouti与PMEL的表达量均与毛纤维中黑色素含量相关。本研究为揭示羊驼毛色的分子机制提供理论基础,为分子育种提供了重要的理论依据。

IGF-1对羊驼皮肤成纤维细胞作用的研究

旨在通过研究胰岛素样生长因子1(IGF-1)对羊驼皮肤成纤维细胞的作用来了解IGF-1对羊驼毛皮生长发育的调控作用。本研究中,(1)利用免疫组织和细胞化学技术,研究IGF-1及其受体IGF-1R在成年羊驼皮肤和培养的成纤维细胞中的表达;(2)观察不同浓度体外重组人IGF-1对成纤维细胞增殖形态学的影响;(3)采用QRT-PCR技术检测添加不同浓度IGF-1对成纤维细胞的IGF-1R、转化生长因子β1(TGF-β1)和角质细胞生长因子(KGF)基因表达量的影响。结果:(1)IGF-1及其受体IGF-1R蛋白在成年羊驼皮肤和培养的成纤维细胞中均有表达;(2)添加IGF-1对成纤维细胞的数量和形态都有明显促进作用,10ng·mL-1组的效果最显著;(3)IGF-1影响成纤维细胞的IGF-1R、TGF-β1和KFG基因的表达。与对照组相比,10ng·mL-1时KGF基因表达水平是3.332倍,IGF-1R基因表达水平是4.479倍。TGF-β1基因表达水平最低为0.405倍,1ng·mL-1时为0.813倍,100ng·mL-1时为0.434倍。结果表明,成纤维细胞既是IGF-1作用的靶器官,又是内分泌器官。IGF-1促进细胞增殖,同时提高其IGF-1R和KGF基因表达量,降低TGF-β1基因表达量,提示IGF-1可通过调节其受体和内分泌因子的表达量而调控羊驼毛的生长发育。

APC在羊驼皮肤组织中的表达和定位分析

本试验旨在研究大肠腺瘤样息肉(APC)在不同毛色羊驼皮肤中的表达及定位情况,探究其与毛色之间的关系。本试验采用实时荧光定量PCR方法检测APC在棕色和白色羊驼皮肤中的mRNA表达情况;采用免疫组织化学方法研究其蛋白的定位及表达水平。实时荧光定量PCR结果显示,APC在棕色羊驼皮肤组织中的相对基因表达量是白色羊驼皮肤组织的5.042 2倍;免疫组织化学结果显示,APC在羊驼皮肤毛囊的毛球及毛根处和表皮部位呈阳性表达;且在棕色羊驼中的表达量高于白色羊驼,提示APC可能参与羊驼被毛颜色的形成。

两种培养基对羊驼毛囊干细胞生长和增殖的影响

目的比较K-SFM和DMEM/F12两种培养基对羊驼毛囊干细胞生长和增殖的影响。方法取2-3岁羊驼背部皮肤,采用联合酶消化法分离毛囊干细胞,用无血清角质化培养基(K-SFM)和自配无血清培养基(DMEM/F12)培养羊驼毛囊干细胞,比较羊驼毛囊干细胞的生长状况,用CK19、integrin-β1特异性标志物免疫细胞化学鉴定细胞。结果免疫细胞化学证实所培养的细胞为羊驼毛囊干细胞。两种培养基均能培养一定量的羊驼毛囊干细胞,培养基K-SFM有利于羊驼毛囊干细胞的增殖,细胞生长数量多,细胞克隆形成能力强,增殖速度快;DMEM/F12培养基细胞数量少,细胞活力不强,传代次数少,增殖速度慢。结论成功分离并鉴定了羊驼毛囊干细胞,建立了适于羊驼毛囊干细胞体外扩增的培养基,K-SFM培养基较自配培养基DMEM/F12更适合羊驼毛囊干细胞的体外培养。

真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP-MC1R的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达

旨在构建含有MC1R基因的pcDNA3.1(+)真核重组表达载体,为进一步研究MC1R的生物学功能奠定基础。应用RT-PCR技术从羊驼皮肤cDNA文库中扩增MC1R基因全长cDNA,然后通过双酶切将MC1R基因全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后,通过G418筛选培养,建立稳定的转染体系,直接荧光观察pcDNA3.1/MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过Western Blot方法检测MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。结果表明,成功构建了pcDNA3.1/MC1R重组表达载体,并且发现试验组的毛囊干细胞中表达MC1R蛋白显著高于空白组(P<0.05)。成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1/MC1R,且MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。

Mitf-M在羊驼皮肤组织的表达与序列分析及免疫组织化学定位

【目的】克隆羊驼皮肤组织表达的Mitf-M CDS序列,比较分析羊驼皮肤组织Mitf-M的特征,进一步定位分析Mitf-M蛋白表达的位置,为深入研究羊驼毛色基因表达机制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增方法分段扩增Mitf-M CDS区,分别利用Clustal X和BioEdit生物学软件对氨基酸序列进行多重序列比较分析,免疫组织化学技术对Mitf-M蛋白定位分析。【结果】羊驼皮肤组织表达的Mitf-M的CDS区由419个氨基酸组成,具有bHLH-zip转录家族的保守结构域,该基因与牛和犬亲缘关系最近,Mitf-M蛋白主要分布于羊驼皮肤组织毛球基底层细胞之间与毛乳头周围的黑色素细胞中。【结论】与其它物种相比较,羊驼皮肤组织表达的Mitf-M蛋白保守性很强,在进化过程中的变异不大,可见Mitf-M为毛发的色素沉积提供重要的物质基础。

小羊驼被毛的物理性能

通过实验对我国新引进小羊驼 (Lamapacos)被毛的各项物理性能进行了测定。小羊驼被毛分为粗毛 (有髓毛 )和细毛 (无髓毛 ) ,其被毛的平均伸直长度为 (148± 2 4.9)mm ,粗毛和细毛的平均直径分别为 (40±6 .0 5 ) μm和 (17.2± 3 .0 1) μm ,平均断裂强度、断裂伸长率分别为 (1.87± 0 .5 2 )cN/dtex、(35 .3± 3.6 7) %。小羊驼被毛的髓质含量少、鳞片类型单一 ,是优质的毛纺材料。

霍奎耶羊驼皮肤毛囊兴盛期结构分析

为阐明羊驼绒毛生长发育提供组织学基础,同时也为毛用动物的遗传改良提供重要的理论依据,通过制作霍奎耶羊驼皮肤组织切片,在显微镜下观察其毛囊兴盛期结构,结果表明霍奎耶羊驼的毛囊结构同其他动物一样,由毛球、连接组织鞘、内根鞘、外根鞘和毛干几部分组成。兴盛期毛囊直径从上到下逐渐增大,末端膨大为毛球,呈一漏斗状,毛球内陷深入形成毛乳头。毛囊群中毛囊的数量较多,且由少量的结缔组织分为两小群。

羊驼毛纤维中黑色素含量的相关性研究

为研究羊驼毛纤维中黑色素含量的相关性,以为建立鉴定羊驼毛色的参数标准提供理论依据。选择肉眼观察认为表型不同的22种自然毛色的羊驼,每个表型选取3只羊驼,从背部采集羊驼毛,用不同的方法溶解,以乌贼黑为标准品,用紫外分光光度计法测定羊驼毛纤维中碱性可溶总黑色素(ASM)、真黑素(EM)和褐黑素(PM)的含量,通过单因素方差和线性回归曲线分别分析不同毛色羊驼毛纤维中黑色素的差异性和相关性。结果表明:ASM和EM在不同毛色的毛纤维中呈差异显著(分别为P<0.01和P<0.05),而PM呈差异不显著(P>0.05)。线性回归曲线得到模式方程式:模式1:Sp.ASM=-0.313+3.168×Sp.EM+E(R2:0.902,t=-3.732,P=0.000,E为误差项;模式2:Sp.EM=0.285+0.143×Sp.ASM+E(R2:0.902,t=6.769,P=0.000,E为误差项。因此,羊驼ASM和EM与毛色具有很大的相关性,可以作为区别毛色的重要参数,二者间存在线性回归。

microRNAs在动物皮肤及毛囊发育中的调控作用研究进展

基因表达调控是动物被毛生长和发育的决定性因素。microRNA作为一种新发现的基因调控元件,在多种哺乳动物皮肤及毛囊中均有表达,并在转录后水平调节皮肤和毛发的生长和发育过程。从microRNA水平上解析绵羊、山羊及羊驼等被毛生长特点及发生机理,为提高毛用型经济动物的毛发品质和产量提供新的思路,同时也为更深入地研究皮肤组织中microRNA的功能提供更多的理论依据。作者主要针对目前已报道的在绵羊、山羊及羊驼等哺乳动物皮肤及毛囊发育中microRNA的调控作用进行综述。

miR-193b及其靶基因Kit在不同毛色羊驼皮肤中的表达

本研究旨在检测miR-193b及其靶基因Kit在不同毛色羊驼皮肤中的表达,并分析它们与羊驼毛色的关系。试验以不同毛色的成年羊驼为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术(QRT-PCR)对miR-193b及Kit在不同毛色羊驼皮肤中的相对表达量进行检测。结果显示,miR-193b在棕色羊驼中显著表达,其相对表达量是白色羊驼的1.741346倍;而Kit在白色羊驼中显著表达,其相对表达量是棕色羊驼的4.6029倍。通过以上研究结果显示miR-193b及其靶基因Kit可能参与羊驼毛色形成过程。提示,miR-193b可能通过负调控Kit参与羊驼毛色形成。

羊驼皮肤基因转录因子及其结合位点分析

哺乳动物皮肤具有多种功能,这些功能是由基因决定的,而基因的表达要受到转录因子的调节。本研究通过参照人皮肤基因的转录因子分析羊驼皮肤的EST库,发现了8个转录因子和6个转录因子结合位点,它们调控着羊驼生活适应性、皮肤生理特征以及皮肤衍生物的生理特性等,其中重要的有调控羊驼黑色素细胞内决定其毛色的转录因子microphthal-mia-associated transcription factor(MITF)及其结合位点cyclic adenosine monophosphate response element-binding 1(CREB-1),用实时荧光定量PCR法检测发现二者在不同羊驼毛色皮肤中的表达在转录水平存在显著差异,它们的生物学特点对研究羊驼皮肤中决定羊驼皮肤生理功能和羊驼毛色的分子机理提供了重要的理论基础。

羊驼胎儿毛囊结构的形态学观察

选择8月龄的羊驼胎儿,颈部取皮肤组织进行石蜡切片,HE染色,观察羊驼胎儿期毛囊形态学结构。结果表明,羊驼胎儿期毛囊在生长过程中的不同结构形态,包括生长期、退化期、静止期以及各期之间的过渡形态结构。生长期的特点是毛球细胞快速增殖,毛乳头包被在毛球内;退化期毛囊底部密封,形成上皮束;静止期整个毛囊的组织结构变短,毛球细胞接近干细胞。

超声波与蛋白酶协同处理对羊驼毛染色的影响

针对羊驼毛鳞片层的致密结构造成染料大分子向纤维内部扩散,其阻力引起上染率低的问题,采用超声波与蛋白酶协同预处理方法,改变预处理工艺的各项技术参数,研究经超声波与蛋白酶协同处理羊驼毛表面鳞片层,促进上染率提高的可行性。结果表明:当预处理液在超声频率为40 kHz,功率为900 W的作用下,蛋白酶用量为3%,预处理温度为50℃,预处理时间为60 min,预处理液的pH值为8.0时,羊驼毛经预处理改性后再染色,与未经预处理的传统染色工艺相比,上染率由75.18%提高到88.83%,固色率由73.29%上升到87.77%,断裂强力与断裂伸长率只是略有降低,符合羊驼毛粗纺生产要求。

周期素依赖性蛋白激酶-5在不同毛色羊驼皮肤中的表达

本研究旨在探索周期素依赖性蛋白激酶-5(CDK5)在羊驼皮肤中的表达与功能。以不同毛色的成年羊驼为研究对象,采用免疫组织化学法对CDK5在羊驼皮肤中的表达进行定位和定性研究,并利用实时荧光定量PCR技术分析了不同毛色羊驼皮肤CDK5基因的相对表达量。免疫组织化学结果显示CDK5在羊驼皮肤毛囊的外根鞘和毛球部呈阳性表达,根据光密度值分析得出CDK5在不同毛色羊驼毛囊中的表达差异显著(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中CDK5mRNA相对基因表达量是白色羊驼的1.6245倍。结果提示CDK5可能与羊驼毛色形成相关。

干细胞因子及其受体c-KIT对羊驼毛囊黑色素细胞增殖与分化的影响及其机制

目的探讨SCF/c-KIT信号通路对羊驼毛囊黑色素细胞分化、增殖和定位的作用及羊驼丰富毛色性状形成的细胞学机制。方法选取8只成年雄性羊驼(4只有色被毛,4只白色被毛),采用免疫组织化学方法研究SCF和c-KIT受体在羊驼皮肤组织中的表达定位;采用实时定量PCR方法分析SCF和c-kit基因在羊驼皮肤组织中的表达水平。结果 SCF和c-KIT受体在不同毛色皮肤组织中均有表达,但在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中的表达量和表达部位存在差异;ΔΔCt法统计分析SCF和c-kit基因在不同颜色被毛羊驼皮肤组织中的表达情况显示,SCF基因在有色被毛皮肤组织中的相对表达量是白色被毛皮肤组织的2.41倍,而c-kit基因在有色被毛皮肤组织中的相对表达量是白色被毛组织的1.20倍。结论 SCF/c-KIT信号通路参与调节黑色素细胞在皮肤组织中的增殖、分化;成熟黑色素细胞的数量及其在毛囊组织中的分布位置决定羊驼被毛颜色的形成;SCF信号调节不同分化程度黑色素细胞在毛囊组织中的分布。

不同被毛颜色羊驼皮肤组织中成熟黑色素细胞的组织学分析

羊驼是已知家养动物中天然被毛颜色最为丰富的动物之一,本研究旨在在组织水平上观察不同被毛颜色羊驼皮肤组织中成熟黑色素细胞的分布与定位,以揭示羊驼丰富被毛颜色发生的细胞学机制。试验选择白色被毛和有色被毛成年羊驼各1头,盛毛期体侧取样,制备石蜡切片,分别采用多巴染色、甲苯胺蓝染色及多巴—甲苯胺蓝复染,光镜观察、拍照。结果表明,在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中均有成熟黑色素细胞的分布,但是分布规律不同,在有色被毛皮肤组织主要分布于毛根成形部,在毛根永久部及表皮也有分布,但是数量较少;白色被毛组织主要分布于表皮,在毛根成形部分布很少,而在真皮部及毛根永久部有少量分布。结果提示:1)羊驼不同被毛颜色发生取决于毛根成形部成熟黑色素细胞的数量;2)从一个侧面佐证了毛囊黑色素细胞与皮肤黑色素细胞在执行功能以及它们所接受的调节信号是不同的。

一氧化氮合酶异构体在不同毛色羊驼皮肤毛囊中的存在差异

【目的】研究羊驼皮肤毛囊中一氧化氮合酶(nitric oxide synthases,NOS)的存在差异。【方法】Dopa染色定位黑色素细胞;利用免疫组化和免疫印迹技术对不同毛色羊驼皮肤毛囊中NOS进行定位与定量分析,分析NOS在不同毛色羊驼皮肤毛囊中表达的差异。【结果】Dopa染色显示黑色素细胞存在于羊驼毛囊鞘和毛乳头中。免疫组化结果显示3种NOS在白毛组和棕毛组皮肤毛囊中均有阳性产物。NOS1和NOS3表达呈弱阳性,NOS2表达呈强阳性;NOS1在毛乳头细胞无阳性产物,在白毛组毛囊鞘细胞与棕毛组无显著差异(P>0.05);NOS2在棕毛组毛囊鞘细胞与白毛组无显著差异(P>0.05),在棕毛组毛乳头细胞极显著高于白毛组(P<0.01);NOS3在毛囊鞘细胞无阳性产物,在白毛组毛乳头细胞与棕毛组无显著差异(P>0.05)。免疫印迹显示NOS2在棕毛组显著高于白毛组(P<0.05)。【结论】NOS2参与调节羊驼毛色形成,为NO信号调节羊驼毛色形成机制的研究提供试验数据。

c-myc蛋白在不同毛色羊驼皮肤中的定位及表达

为了探索c-myc蛋白在羊驼皮肤中的定位及表达情况,以不同毛色的成年羊驼为研究对象,采用免疫组织化学方法检测c-myc蛋白在羊驼皮肤组织中的表达和定位。结果显示,c-myc在羊驼皮肤毛囊毛球部细胞中呈阳性表达,根据光密度值分析得出c-myc在棕色羊驼毛囊中显著表达,其相对表达量是白色羊驼的5.51倍。研究表明c-myc可能参与羊驼毛色形成。

羊驼毛囊干细胞分离、培养与鉴定

采用0．2％中性蛋白酶Ⅱ和0．25％胰酶：0．02％EDTA（1：1）“两步酶”消化法从羊驼背部皮肤分离得到羊驼毛囊干细胞。用无血清角质细胞培养基（K-SFM）培养进行形态学观察、细胞生长曲线克隆形成率及免疫组化染色检测。结果显示，细胞生长曲线表明，不同代次毛囊干细胞接种前3d生长缓慢，4～6d进入倍增期，有无限增殖的趋势，所分离的羊驼毛囊干细胞具备毛囊干细胞特征（体积小、立体感强），呈现未分化特征；CK19、CK15、81-integrin和CD34免疫组化染色阳性；第3、5、7、9代克隆形成率分别为（32．7±2．27）％、（47．0±3．46）％、（46．3±3．18）％和（43．3±3．76）％。结果表明，用“两步酶”消化法成功分离获得羊驼毛囊干细胞，无血清角质细胞培养基（K—SFM）可使羊驼毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至12代。