基于lncGAS5/DNMT3A通路探讨心康冲剂对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

目的 探讨心康冲剂调控长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5(long non-coding RNA growth arrest specific transcript 5,lncGAS5)/DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)通路抗慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的机制。方法 62只SD大鼠,其中随机取6只大鼠为正常组,余56只经腹腔注射阿霉素药物建立慢性心力衰竭模型,将造模成功的52只大鼠随机分为模型组12只(注射PBS+生理盐水灌胃),GAS5沉默组(注射AAV9-GAS5-RNAi病毒+生理盐水灌胃)、阴性对照组(注射AAV NC病毒+生理盐水灌胃)、心康冲剂组(注射AAV9-GAS5-RNAi病毒+心康冲剂溶液灌胃)、缬沙坦组(注射AAV9-GAS5-RNAi病毒+缬沙坦溶液灌胃)各10只。分组处理后,心脏超声检测各组大鼠心功能;Masson染色观察心脏组织形态;免疫荧光染色检测各组大鼠左心室纤维化蛋白α-SMA表达;酶联免疫吸附法检测大鼠血清Col I表达;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠心尖组织lncGAS5、DNMT3A mRNA;Western blot法检测DNMT3A、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)、磷酸化蛋白质激酶蛋白B(phosphorylated protein kinase B,AKT)各蛋白表达量。结果 与正常组相比,模型组大鼠左室射血分数(left ventricular ejection fractions, LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)均明显降低(P<0.05);染色结果显示心肌纤维化严重;血液中I型胶原(type I collagen, Col I)明显升高(P<0.05);lncGAS5 mRNA表达降低,DNMT3A mRNA及蛋白表达升高,PTEN蛋白表达降低,AKT蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,GAS5沉默组染色或指标结果进一步降低或升高;与GAS5沉默组相比,染色结果显示心康冲剂、缬沙坦组干预后心肌纤维化减轻,LVEF、LVFS都不同程度地增加(P<0.05);血清中Col I水平降低;lncGAS5mRNA表达升高,DNMT3AmRNA表达降低;DNMT3A、AKT蛋白表达降低,PTEN蛋白表达升高(P<0.05)。结论 心康冲剂可通过调控lncGAS5/DNMT3A/PTEN/AKT通路及下游纤维化因子,从而改善慢性心力衰竭之心肌纤维化。

转位蛋白基因在FLT3-ITD/DNMT3A R882双突变急性髓系白血病疗效评估中的价值

目的:观察转位蛋白(TSPO)基因在FLT3-ITD/DNMT3A R882双突变急性髓系白血病(AML)疗效评估中的价值。方法:纳入2018年6月至2020年6月在宁波大学附属人民医院血液科住院治疗的初发AML患者76例,其中伴有FLT3-ITD突变34例,伴有DNMT3A R882突变27例,伴有FLT3-ITD/DNMT3A R882双突变15例,对照组为同期住院治疗的免疫性血小板减少症(ITP)患者19例。骨髓穿刺留取骨髓3 ml,常规提取RNA,通过转录组测序方法检测TSPO基因的表达量(使用2^(-ΔΔCT)法计算)。结果:FLT3-ITD单突变组和DNMT3A R882单突变组初诊时TSPO基因表达量分别为2.02±1.04、1.85±0.76,均高于对照组的1.00±0.06,但比较差异无统计学意义(P=0.671,P=0.821);双突变组初诊时TSPO基因表达量为3.98±1.07,明显高于FLT3-ITD单突变组和DNMT3A R882单突变组(P=0.032,P=0.021);双突变组化疗后达到完全缓解的患者,达到完全缓解时的TSPO基因表达量为1.19±0.87,明显低于其初诊时的水平(P=0.011)。结论:TSPO基因或许可以作为评估FLT3-ITD/DNMT3A R882双突变AML治疗疗效的一个指标。

DNMT3A对高糖环境下小鼠心肌成纤维细胞增殖与迁移的影响

目的探讨DNA甲基化转移酶3A(DNA methyltransferases 3A,DNMT3A)在高糖环境下对小鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖与迁移的作用。方法取新生C57乳鼠心脏,剪碎后提取CFs,在显微镜下观察并鉴定形态。细胞贴壁后分别在低糖(5.5 mmol·L^(-1))培养基和高糖(33.0 mmol·L^(-1))培养基下培养,并使用DNMT3A慢病毒(沉默DNMT3A基因)处理。应用qRT-PCR方法检测DNMT3A、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型胶原A1(CollagenⅠA1,Col1A1)的mRNA表达变化;应用Western blot方法检测DNMT3A、α-SMA、Col1A1的蛋白表达变化;CCK-8与MTT法检测CFs增殖活性;划痕实验与Transwell迁移实验检测CFs迁移能力。结果与低糖培养的对照组CFs相比,高糖环境诱导了CFs的DNMT3A表达水平升高与胶原纤维沉积,同时CFs的异常活化明显增强。使用慢病毒处理沉默高糖环境下CFs DNMT3A表达后,与空载体组相比,沉默组DNMT3A表达下调,胶原纤维沉积减少,同时CFs的异常增殖与活化明显降低。结论沉默DNMT3A能抑制高糖诱导的胶原沉积与CFs异常活化增殖,DNMT3A通过刺激高糖环境下CFs异常活化与增殖导致糖尿病心肌纤维化和DCM的发生与发展。

伴孤立性i(17)(q10)和FLT3-ITD/DNMT3A R882双突变急性髓系白血病1例并文献复习

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一组由造血系统中异常分化的髓系细胞恶性克隆增殖导致的高度异质性疾病,越来越多的证据表明,细胞遗传学和分子遗传学特征在AML的发病机制、分类和治疗中起着关键作用[1]。等臂染色体i(17q)是着丝粒断裂或异常分裂的产物,导致17号染色体长臂重复和短臂丢失[2]。i(17q)在血液系统肿瘤中往往同其他染色体异常一起出现,孤立性i(17q)染色体异常在血液系统肿瘤中较为少见。在AML中孤立性i(17q)罕见,截至目前,国内外仅见几十例报道,常提示患者预后极差[3]。

左归降糖清肝方对糖尿病性脂肪肝小鼠PGC-1α和DNMT3A表达的影响

目的探讨左归降糖清肝方对高脂饮食2型糖尿病转基因MKR鼠脂肪肝发生中过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferation-activated receptor-γ-coactivator 1α,PGC-1α)和DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)表达的影响。方法24只MKR鼠随机分为对照组、高脂模型组和左归降糖清肝方(中药方)组;高脂模型组和中药方组均以高脂饲料喂养8周,对照组以基础饲料喂养;中药方组高脂饲料喂养4周后,以中药汤剂灌胃干预治疗4周,其他组灌胃等量的蒸馏水。采用电化学法检测空腹血糖;试剂盒测定肝组织甘油三酯(triglyceride,TG)和游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)含量;HE染色观察肝组织形态结构及病理变化;qRT-PCR检测小鼠肝组织PGC-1α、线粒体转录因子A(mitochondrial transcriptionfactor A,TFAM)、核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor 1,NRF1)和DNMT3A mRNA表达;Western blot和免疫组织化学检测PGC-1α和DNMT3A蛋白表达。结果高脂饮食诱发MKR鼠形成糖尿病性脂肪肝,肝细胞有大小不一的脂滴,呈脂肪性变;与对照组比较,高脂模型组小鼠血糖、肝指数和肝组织TG和FFA含量显著上升(P<0.01),肝脏PGC-1α、NRF1和TFAM的mRNA及PGC-1α蛋白表达显著下降(P<0.01),而DNMT3A mRNA和蛋白表达均显著上升(P<0.01)。与高脂模型组比较,左归降糖清肝方降低了高脂饮食MKR鼠血糖、肝指数和肝组织TG和FFA含量(P<0.01),上调了肝脏PGC-1α、NRF1和TFAM的mRNA表达,以及PGC-1α蛋白表达(P<0.01),下调了DNMT3A的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。结论左归降糖清肝方通过调节肝脏PGC-1α及其通路相关基因表达,缓解糖尿病性脂肪肝小鼠肝脏脂肪性变,其机制可能通过抑制DNA甲基转移酶3A表达,减少PGC-1αDNA的甲基化相关。

海洛因通过下调DNMT3a抑制印记基因H19启动子甲基化促进雄鼠的子代成瘾与复吸的机制

目的探讨F0代雄鼠吸食海洛因对F1代大鼠成瘾与复吸的影响及机制。方法用不同剂量(1、3、9 mg·kg^(-1))海洛因处理F0代雄鼠。Western blot检测F0代雄鼠精子和F1代大鼠背侧海马组织中DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)蛋白表达水平。DNA甲基化免疫共沉淀(MeDIP)-qRT-PCR检测H19启动子甲基化率。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测H19 mRNA表达水平。构建海洛因自身给药模型,检测F1代各组大鼠的成瘾与复吸行为。结果海洛因明显降低F0代雄鼠精子中DNMT3a蛋白表达水平及H19启动子甲基化率,明显提高H19 mRNA表达水平(P<0.05)。F0代雄鼠吸食海洛因明显降低F1代大鼠背侧海马组织中H19启动子甲基化率,明显提高H19 mRNA表达水平(P<0.05)。F0代雄鼠吸食海洛因明显增加F1代大鼠在海洛因自身给药实验和复吸实验中的有效鼻触次数(P<0.05)。结论F0代雄鼠吸食海洛因会促进F1代大鼠对海洛因的成瘾与复吸,其机制可能与海洛因通过下调F0代雄鼠精子中DNMT3a表达抑制印记基因H19启动子甲基化,进而促进F1代大鼠背侧海马组织中H19 mRNA表达有关。

DNMT3A对骨关节炎软骨细胞SOX9基因DNA甲基化修饰的影响

目的探讨DNMT3A对SOX9基因DNA甲基化修饰的影响。方法培养正常软骨细胞和OA软骨细胞,显微镜下观察软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原染色鉴定软骨细胞,qRT-PCR、Western Blot检测DNMT3A、SOX9 mRNA和蛋白表达水平,亚硫酸氢盐测序检测SOX9基因DNA甲基化状态,慢病毒沉默DNMT3A观察SOX9基因DNA甲基化修饰的变化。结果正常软骨细胞形态规则,体积较大,数量较多,OA软骨细胞形态不规则,体积较小,数量较少。与正常软骨细胞比较,OA软骨细胞中DNMT3A mRNA和蛋白表达量增高(P<0.05),SOX9 mRNA和蛋白表达量明显降低(P<0.05),SOX9基因DNA甲基化百分比增高。在OA软骨细胞中沉默DNMT3A后,SOX9基因DNA甲基化百分比明显降低。结论DNMT3A调节SOX9基因DNA甲基化修饰参与OA软骨细胞病变。

磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸肌醇-3-激酶对原发性肝癌TACE治疗反应的预测作用

目的探讨经导管动脉化疗栓塞术(TACE)治疗的原发性肝癌患者磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸肌醇-3-激酶(PIK3CA)的表达及其与TACE治疗反应的相关性。方法从TCGA数据库下载425例肝癌患者PIK3CA的表达量。利用GSE104580数据集内TACE治疗敏感和不敏感患者癌组织PIK3CA表达量,分析两组基因表达差异,绘制ROC曲线分析TACE治疗敏感性与PIK3CA表达的相关性。从GSE14520数据集下载具有完整临床资料、接受TACE治疗的肝细胞癌27例,基于PIK3CA的表达量最佳截断值,分成PIK3CA高表达组和PIK3CA低表达组,比较两组患者的临床资料。应用“survminer”R包进行Kaplan-Meier生存分析。结果肝癌组织PIK3CA表达明显高于癌旁组织;TACE不敏感患者癌组织PIK3CA表达量高于TACE敏感患者,TACE治疗敏感性与PIK3CA表达相关性的ROC曲线下面积(AUC)为0.645;生存分析显示PIK3CA表达量越低,患者生存时间越长,且1、2、3年的AUC分别为0.765、0.713、0.633。结论PIK3CA对于肝细胞癌有一定的诊断价值,有可能作为TACE治疗敏感性的预测指标。

Gabra3通过AKT/mTOR途径促进膀胱癌T24细胞侵袭和迁移

目的:探究γ-氨基丁酸受体亚基α-3(Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-3,Gabra3)基因对膀胱癌T24细胞凋亡、迁移和侵袭的作用及其机制。方法:TCGA数据库分析Gabra3基因在膀胱癌中的表达以及转移和生存的相关性。建立Gabra3过表达和Gabra3突变的T24细胞株,根据转染质粒不同,分为空白T24细胞(Control)、空pDONR223载体转染T24细胞(NC)、野生型Gabra3过表达T24细胞株(wt-Gabra3)、突变型Gabra3 T24细胞株(mut-Gabra3)。在回补实验中,分为转染突变型Gabra3 T24组(mut-Gabra3)、转染空pDONR223载体mut-Gabra3组(mut-Gabra3-NC)、转染野生型Gabra3过表达组(mut-Gabra3+wt-Gabra3)。用TUNEL染色检测T24细胞凋亡,细胞划痕和Transwell分别检测T24细胞迁移和侵袭,Western blot检测AKT/mTOR通路相关分子生物表达水平。结果:Gabra3基因在膀胱癌中显著高表达(P<0.05),生存曲线证实远处转移存在的患者生存期明显较短(P<0.05)。成功构建Gabra3过表达和突变的T24细胞株。与Control组相比,wt-Gabra3组细胞凋亡能力显著降低,迁移、侵袭能力显著增强(P<0.05),而mut-Gabra3组细胞凋亡显著增加,侵袭能力显著减弱(P<0.05);wt-Gabra3组细胞p-AKT、p-mTOR、p-4E-BP1、p-S6K蛋白表达均显示上凋(P<0.05),而mut-Gabra3组细胞上述蛋白无差异。在回补实验中,过表达wt-Gabra3的mut-Gabra3突变T24细胞凋亡能力受到抑制(P<0.05),迁移和侵袭能力显著增强(P<0.05),并且该组细胞AKT/mTOR通路相关分子显著激活(P<0.05)。结论:外源性的未编辑的Gabra3可以促进膀胱癌T24细胞的迁移、侵袭能力,并且可能与激活AKT/mTOR途径通路密切相关。

联合检测CHI3L1、AFP和GGT在乙肝相关肝癌患者中的相关性研究

目的探讨血清壳多糖酶3样蛋白1(chitinase-3-like protein 1,CHI3L1)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)和γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyl transferase,GGT)检测在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染相关肝癌诊断中的临床应用价值。方法选取2021年7月—2023年7月在玉林市第一人民医院就诊HBV病毒感染相关的50例肝癌患者,50例肝硬化患者,50例慢性乙型肝炎患者以及50名同期健康体检者作为研究对象。比较4组研究对象血清中CHI3L1、AFP、GGT、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)等水平的差异,用受试者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线评估各指标在肝癌中的诊断价值。结果肝炎组、肝硬化组、肝癌组的CHI3L1、AST、ALT水平均高于对照组,肝癌组AFP、GGT水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与肝炎组比较,肝硬化组及肝癌组的CHI3L1、AFP、GGT、AST、ALT水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与肝硬化组比较,肝癌组的CHI3L1、AFP、GGT、AST水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析显示,CHI3L1、AFP、GGT联合时的曲线下面积(area under the curve,AUC)最大(AUC=0.936)。Spearman相关分析结果显示,CHI3L1与AST呈正相关(r=0.414,P=0.003),AFP与GGT呈正相关(r=0.437,P=0.002),AFP与AST呈正相关(r=0.504,P<0.001),GGT与AST呈正相关(r=0.759,P<0.001),GGT与ALT呈正相关(r=0.636,P<0.001)。结论CHI3L1、AFP及GGT联合检测可提高肝癌的诊断价值,对临床肝癌患者诊疗有重要作用。

羧甲司坦口服溶液联合重组人干扰素α1b治疗小儿急性喘息性支气管炎的效果

目的分析急性喘息性支气管炎患儿接受重组人干扰素α1b单药与联合羧甲司坦口服溶液治疗的效果。方法回顾性分析2021年6月至2023年6月医院收治的100例急性喘息性支气管炎患儿资料,按不同治疗方案分为对照组、观察组,各50例。对照组接受重组人干扰素α1b治疗,观察组接受羧甲司坦口服溶液联合重组人干扰素α1b治疗。比较两组临床疗效、主要症状缓解时间、气道炎症相关因子[趋化因子配体3(CCL3)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、α1-酸性糖蛋白(α1-AG)]、T淋巴细胞(CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))及不良反应。结果观察组临床总有效率高于对照组(P<0.05)。治疗后观察组气促、喘息、咳嗽、肺部音等症状缓解时间降低(P<0.05)。治疗4、7 d后,两组CCL3、HMGB1、α1-AG较治疗前下降,且观察组低于对照组(P<0.05);两组CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)较治疗前升高,且观察组高于对照组(P<0.05)。两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论羧甲司坦口服溶液联合重组人干扰素α1b治疗急性喘息性支气管炎,可抑制气道炎症,调节机体免疫,促进症状缓解,疗效确切,且安全性高。

散发性乳腺癌中DNMT3a、DNMT3b表达与ERα基因启动子甲基化状态及蛋白表达的关系

目的探讨散发性乳腺癌中DNA甲基转移酶（DNMT）3a、DNMT3b蛋白表达情况及其与雌激素受体（ER）α基因启动子甲基化状态及蛋白表达的关系。方法选取180例散发性乳腺癌与30例乳腺纤维腺瘤组织,采用免疫组化法检测组织中DNMT3a、DNMT3b蛋白的表达情况,甲基化特异性PCR检测97例散发性乳腺癌中ERα基因启动子的甲基化状态。结果乳腺纤维腺瘤与乳腺癌组织中的DNMT3a、DNMT3b蛋白阳性表达率差异无统计学意义;Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌组织的DNMT3a、DNMT3b水平高于Ⅰ-Ⅱ期,有淋巴结转移者的DNMT3a表达水平高于无淋巴结转移者（均P〈0.05）;97例乳腺癌中有39例（40.2%）发生ERα基因启动子甲基化,DNMT3a蛋白阳性表达与ERα基因甲基化呈正相关（rs=0.250）;DNMT3a蛋白表达对患者的总体生存期（OS）有显著影响（P=0.035）,对无病生存期（DFS）无明显影响（P=0.064）,DNMT3b蛋白表达对患者的OS和DFS无影响（P分别为0.914、0.961）。结论DNMT3a、DNMT3b阳性表达与乳腺癌侵袭转移、病程进展、预后相关;DNMT3a与ERα基因启动子甲基化状态呈正相关;抑制DNMT3a、DNMT3b蛋白可能有利于散发性乳腺癌的预防和治疗。

急性髓系白血病中DNMT3a基因突变的研究

本研究探讨急性髓系白血病(AML)患者DNMT3a基因突变情况及临床特征。采用PCR扩增产物直接测序法检测77例AML患者DNMT3a基因第882位氨基酸的突变情况,分析突变阳性患者的临床特征。结果表明,59例初诊AML患者中7例(11.9%)具有DNMT3a基因突变,突变类型分别为4例DNMT3a R882C、2例DNMT3aR882H和1例DNMT3a Y874C。7例DNMT3a基因突变患者中2例为M2、1例为M4、4例为M5。27例正常核型中5例(22.7%)发生突变,而21例异常核型中无1例发生突变。CEBPA阳性患者发生DNMT3a突变率明显高于CEBPA阴性患者(p=0.002)。突变患者中有4例(4/7,57.1%)伴有淋系抗原CD4和/或CD7的表达。DNMT3a突变组患者的年龄、性别、骨髓原始细胞数、白细胞数、血小板数、血红蛋白、完全缓解(CR)率、FLT3-ITD、NPM1和c-kit突变与DNMT3a野生型组相比均无统计学意义(p>0.05)。结论:DNMT3a基因突变多见于正常染色体核型AML伴NPM1和/或CEBPA突变阳性患者,其在AML患者预后中的预测价值有待于进一步的深入研究。

急性髓系白血病中DNMT3A p.R882的共存基因突变分析

目的:探讨急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)p.R882的共存基因突变及其与部分临床参数间的相关性。方法:采用高通量DNA测序技术检测49种靶基因;采用基因组DNA-PCR联合Sanger测序法检测患者中DNMT3A p.R882、CALR基因9号外显子、NPM1基因12号外显子、FLT3-ITD,及CEBPA的TAD、BZIP两个功能结构域的突变发生情况。结果:①301例患者中共检出41例携带DNMT3A p.R882突变,最常见为M5亚型;97.6%(40/41)DNMT3A p.R882突变患者同时携带其他基因突变,每例患者平均突变3.17次;其中双基因突变9例,3个基因突变共存12例,≥4个基因突变共存19例。②DNMT3A p.R882伴随基因突变最常见的为NPM1(n=27,65.9%),其他依次为:FLT3-ITD(n=18,43.9%)、IDH1(n=9,22.0%)、TET2(n=8,19.5%)及NRAS(n=6,14.6%)等;③≥4个基因突变患者的白细胞水平虽然高于双基因及3个基因突变者,但差异无统计学意义(P>0.05),同样血红蛋白及血小板水平差异亦无统计学意义(P>0.05),共存基因突变为FLT3-ITD者的外周白细胞水平高于野生型(P=0.034),但在年龄、血红蛋白及血小板水平方面的差异无统计学意义。伴NPM1、IDH1或TET2突变者与野生型相比,在中位年龄、外周血白细胞水平间的差异均无统计学意义。④与野生型相比,伴NPM1突变者具有更高的初次诱导完全缓解(complete remission,CR)率,而伴IDH1突变者CR率较低,差异均有统计学意义(P=0.010,0.025);伴FLT3-ITD与TET2突变者与野生型相比,在CR率方面的差异无统计学意义。结论:95%以上的DNMT3A p.R882突变AML均伴有额外基因突变,共存基因突变种类及个数对患者的临床特征有一定影响。

DNMT3A调控Drp1对肝星状细胞活化增殖和迁移能力的影响

目的探讨DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)调控动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)介导的线粒体裂变对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化增殖和迁移能力的影响。方法应用5μg·L^(-1)TGF-β1作用24 h诱导HSC-T6细胞活化,DNMT3A慢病毒感染构建DNMT3A沉默模型;实验分为Control组、TGF-β1组、TGF-β1+LV5-NC组和TGF-β1+LV5-DNMT3A组。分别用RT-qPCR和Western blot检测DNMT3A对相关mRNA和蛋白表达的影响;用CCK-8检测细胞活化增殖的情况;分别用细胞划痕、Transwell迁移实验观察DNMT3A对HSCs细胞迁移能力的影响。结果慢病毒感染成功构建DNMT3A沉默模型。与Control组比较,TGF-β1刺激后DNMT3A水平明显升高,纤维化标志物CollagenⅠ和α-SMA的mRNA和蛋白水平明显升高,线粒体裂变标志物Drp1的mRNA和蛋白水平明显升高,同时HSCs细胞的增殖和迁移能力明显增加;而与NC组比较,DNMT3A沉默组DNMT3A水平明显降低,CollagenⅠ、α-SMA和Drp1表达明显被抑制,HSCs细胞的增殖和迁移能力也明显被抑制。结论沉默DNMT3A可抑制Drp1的水平,同时抑制了HSCs细胞的增殖和迁移能力。提示DNMT3A介导低水平的DNA甲基化修饰可能通过抑制Drp1的水平来抑制线粒体裂变的发生,进而抑制HSCs活化,影响肝纤维化疾病的发生发展。

绵羊卵母细胞体外成熟过程中VEGF对DNMT3a表达的影响

旨在探究血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在绵羊卵母细胞体外成熟过程中对DNMT3a的影响。本研究采用RNA干扰和显微注射技术将针对VEGF两个受体FLT1和KDR/Flk-1的有效干扰片段导入到绵羊卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocytes complexes,COCs）中,检测体外成熟培养各时间卵母细胞和颗粒细胞中DNMT3amRNA和蛋白表达水平的变化。结果表明,COCs体外成熟培养过程中,无论是否添加VEGF,卵母细胞内DNMT3amRNA表达量都随着培养时间延续而降低,培养至8h时DNMT3amRNA表达量急速下降,之后下降速度放缓,至24h后各组趋于一致,且未注射干扰片段对照组的下降速度快于其他干扰组（P〈0.01）。添加VEGF组DNMT3amRNA表达量的下降速度快于未添加组。干扰片段导入后发现,FLT1-siRNA和KDR-siRNA复合干扰组干扰效果优于KDR-siRNA干扰组,FLT1-siRNA干扰组干扰效果最弱（P〈0.01）。无论是否添加VEGF,在COCs体外成熟培养过程中,颗粒细胞DNMT3amRNA表达量都随着培养时间延续而降低,且各组表达量差别不大。其中未注射干扰片段对照组的下降速度在COCs成熟培养中期快于其他干扰组（P〈0.05或P〈0.01）,FLT1-siRNA干扰效果较好。无论是否添加VEGF卵母细胞内DNMT3a蛋白表达量从0～4h上升,之后匀速下降,至16h急速下降,24h为零。未导入干扰片段对照组下降速度最快。其中16h对照组、FLT1-siRNA干扰组、KDR-siRNA干扰组和FLT1-siRNA＆KDR-siRNA复合干扰组DNMT3a蛋白表达量,添加VEGF后,分别下降到培养初期的23.12%、31.07%、41.47%和37.90%,未添加VEGF的组则分别下降到培养初期的37.38%、54.60%、57.58%和82.75%。颗粒细胞中,添加VEGF组DNMT3a蛋白表达量呈现逐渐下降趋势,至20h时,已无DNMT3a蛋白表达;未添加VEGF组从0～4h有略微上升,之后呈现逐渐均速下降趋势,20h时,急速下降,至24h时,无DNMT3a蛋白表达,且干扰片段对DNMT3a蛋白表达影响不大,而本身颗粒细胞中DNMT3a蛋白表达量也不高。结果提示,绵羊COCs体外成熟培养过程中,VEGF加快了卵母细胞中DNMT3a mRNA和蛋白表达量的下降速度。而干扰片段的导入则使DNMT3amRNA和蛋白表达量下降速度放缓;颗粒细胞内VEGF的添加和受体干扰片段的导入,对DNMT3amRNA和蛋白表达影响效果不明显。

DNMT3A、FLT3-ITD突变与AML患者不良预后的相关性

目的探讨FLT3-ITD及DNMT3A突变对细胞遗传学中等风险的急性髓系白血病(AML)患者预后评估的价值。方法选取2010—2016年美国俄勒冈州健康与科学大学附属医院收治的AML初诊患者132例,根据细胞遗传学分析结果将患者分为预后良好细胞遗传学组(简称预后良好组)24例、中等风险细胞遗传学组(简称中等风险组)79例、不良风险细胞遗传学组(简称不良风险组)27例,另有细胞遗传学信息不详2例。使用下一代测序(NGS)技术检测与血液系统肿瘤发病相关的42个基因突变。结果 132例AML患者中有120例(91%)至少发生1个基因突变,多基因(≥2)突变占61%。Kaplan-Meier生存曲线显示,在中等风险组中,FLT3-ITD突变阳性组的总体生存期与FLT3-ITD突变阴性组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。进一步分析发现,FLT3-ITD突变阳性+DNMT3A突变组的中位生存期明显短于FLT3-ITD突变阴性组(P<0.001),FLT3-ITD突变阳性+DNMT3A野生型组的中位生存期与FLT3-ITD突变阴性组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。FLT3-ITD突变阳性+DNMT3A突变组的总生存期明显短于FLT3-ITD突变阴性组(P<0.001)和FLT3-ITD突变阳性+DNMT3A野生型组(P=0.003)。结论在细胞遗传学中等风险的AML患者中,如果同时存在FLT3-ITD及DNMT3A突变,提示预后不良。检测FLT3-ITD及DNMT3A突变状态有助于对AML进行预后评估。

胃癌弱差异基因表达谱中DNMT3A基因表达和生物学作用的探讨

目的:明确胃癌差异基因表达谱中弱差异表达基因的敏感性和特异性;探讨胃癌弱差异表达基因DNMT3A在胃癌发生发展中的生物学作用和意义。方法:利用半定量RT/PCR方法验证了胃癌弱差异基因表达谱中DNMT3A基因的表达水平,并利用GoMiner软件研究了DNMT3A的生物学功能。结果:DNMT3A基因在胃癌组织中比癌旁正常组织表达微弱升高,基因表达变化倍数为1.13,与基因芯片的表达变化(1.10)一致;GoMin-er软件功能注释表明DNMT3A在甲基化和转录调控等方面具有重要生物学功能。结论:可以在实验室中利用分子生物学方法验证胃癌差异基因表达谱中的弱差异表达基因;弱差异表达基因DN-MT3A的异常表达与多种肿瘤的发生有密切的联系,并且可能在胃癌的发生发展中具有重要的生物学作用。

DNMT3a通过STAT3及RAD51影响胰腺癌细胞对奥沙利铂敏感性的研究

目的:检测DNMT3a在胰腺癌细胞中的表达及对奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)敏感性的影响,探讨DNMT3a对胰腺癌细胞奥沙利铂敏感性影响的机制。方法:MTT法检测奥沙利铂对人胰腺癌Panc-1细胞的增殖影响,及下调DNMT3a对Panc-1细胞奥沙利铂敏感性的影响。Western blot检测siD NMT3a对DNMT3a蛋白表达的影响,检测奥沙利铂及下调DNMT3a对γ-H2AX、RAD51、p-STAT3和STAT3蛋白表达的影响。流式细胞仪检测奥沙利铂及联合下调DNMT3a对Panc-1细胞凋亡的影响。结果:奥沙利铂能够以浓度依赖方式抑制胰腺癌Panc-1细胞的增殖。奥沙利铂能够引起DNA损伤、γ-H2AX上调及RAD51增高,同时引起STAT3通路的一过性活化。下调DNMT3a表达能够明显增加Panc-1细胞对奥沙利铂的敏感性,抑制STAT3一过性活化,并抑制RAD51表达,促进DNA损伤,进而增加奥沙利铂诱导Panc-1细胞的凋亡。结论:下调DNMT3a表达能够通过抑制STAT3活化及增加DNA损伤增加胰腺癌细胞对奥沙利铂的敏感性,DNMT3a有望成为胰腺癌新的治疗靶点。

敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡

背景:环状RNA(circular RNA,circRNA)在多种疾病或肿瘤中发挥着重要作用,近年研究结果发现,膝骨关节炎中circRNA失常表达,并可通过调控微小RNA(miRNA)/mRNA参与疾病进展。目的:探究circ-BRWD1/miR-488-3p/DNMT3A对膝骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响。方法:实时荧光定量PCR检测膝骨关节炎软骨细胞miR-488-3p、circ-BRWD1、DNMT3A表达。将细胞分为si-NC组、si-circ-BRWD1组、si-circ-BRWD1+anti-miR-NC组、si-circ-BRWD1+anti-miR-488-3p组、vector组、circ-BRWD1组、miR-NC组、miR-488-3p组、miR-488-3p+vector组、miR-488-3p+DNMT3A组、anti-miR-NC组、anti-miR-488-3p组;实时荧光定量PCR检测circ-BRWD1、miR-488-3p、DNMT3A表达,MTT、流式细胞术检测增殖和凋亡,Western blot检测DNMT3A、增殖、凋亡相关蛋白表达;双荧光素酶报告实验检测circ-BRWD1与miR-488-3p、miR-488-3p与DNMT3A的靶向关系。结果与结论:①与正常软骨细胞相比,circ-BRWD1、DNMT3A在膝骨关节炎软骨细胞中高表达,miR-488-3p低表达;②敲低circ-BRWD1或过表达miR-488-3p可抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡;③circ-BRWD1靶向负调控miR-488-3p,抑制miR-488-3p可逆转敲低circ-BRWD1对膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响;④miR-488-3p靶向负调控DNMT3A,上调DNMT3A可逆转过表达miR-488-3p对膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响;⑤circ-BRWD1可通过调控miR-488-3p进而调控DNMT3A的表达;⑥结果表明,敲低circ-BRWD1可抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡,其作用机制可能与调控miR-488-3p/DNMT3A轴有关。