产气荚膜梭菌α毒素荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为利用TaqMan荧光定量PCR技术建立一种快速、敏感、特异的产气荚膜梭菌α毒素检测方法,根据产气荚膜梭菌各型之间共同的生物学特性,以编码产气荚膜梭菌α毒素的基因序列作为靶序列,设计1对引物和探针,分别以A、B、C、D4个型的产气荚膜梭菌DNA为模板,通过优化引物、探针浓度和扩增条件,建立了TaqMan荧光定量PCR方法,同时对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了验证。结果显示:当上下游引物浓度和探针浓度均为0.25μmol/L时,Ct值最低;该方法与大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等细菌均无交叉反应,具有良好的特异性;灵敏度高,对A型产气荚膜梭菌基因组DNA的最低检测限为9.1pg/μL;重复性好,组内及组间试验标准差均小于0.4;对2023年收集的24份样品进行检测,发现本方法的阳性检出率(20.83%)与商品试剂盒一致。综上,本研究建立了一种快速、灵敏、稳定、特异的TaqMan荧光定量PCR方法,可对产气荚膜梭菌α毒素进行快速检测,为防控产气荚膜梭菌病提供了有力的技术支撑。

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

对含有产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）α毒素基因的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１），通过培养性状观察和小鼠接种试验，证明这２株重组菌株均无致病性。随后对这２株重组菌株的表达产物进行了研究，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析，ＩＰＴＧ诱导３～４ｈ后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白３３．２１％，ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白２７．２５％，其相对分子质量约３７５００；经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物可被α毒素抗血清识别。包涵体粗提物的免疫攻毒试验结果表明，以１倍致死量攻击的免疫小鼠可获得１００％（３６／３６）的保护，以２倍致死量攻击的免疫小鼠可获得９４．２８％（３３／３５）的保护，从而说明表达产物具有良好的免疫原性。

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析

将含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有产气荚膜梭菌α毒素基因。确定了α毒素基因的全部核苷酸序列，并证明其具有正确的阅读框架。

C型产气荚膜梭菌α、β_1毒素基因的融合

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出α和β1 毒素基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含αβ1 融合基因表达质粒重组菌株BL2 1 (DE3) (pETXAB1 )。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1含有αβ1 融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的αβ1 融合蛋白能够被α、β1 毒素抗体识别。免疫实验结果表明,αβ1 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9 44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆、表达及其生物学活性(英文)

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株 1A8中 ,分别扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用linker (Gly4Ser) 3 基因 ,将VH 和VL 基因连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中 .经核苷酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及linker基因拼接正确 ,ScFv 1A8基因全长为 72 6bp ,编码2 4 2个氨基酸 ,VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ (A)和轻链κⅣ家簇 .将ScFv 1A8基因克隆至表达载体pHOG2 1中 ,构建了重组质粒pHOG 1A8,然后转化至受体菌XL1 BLUE中 ,得到重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8) .ELISA检测和SDS PAGE分析表明 :经IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8)的胞周质中 .经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE(pHOG 1A8)的蛋白表达产物占菌体可溶性蛋白的 1 2 % ,其相对分子量约为 31kD .ScFv的生物学活性研究表明 ,ScFv蛋白不但具有中和磷脂酶C的活性 。

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体的基因克隆及核苷酸序列分析

应用 RT-PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 ( Mc Ab)的杂交瘤细胞 2 E3中 ,扩增出抗体 VH 和 VL 基因 ,用 linker( Gly4Ser) 3基因 ,将 VH 和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆至 p GEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 6bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH 和VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 ( B)和轻链κ

C型产气荚膜梭菌α、β_1、β_2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kbα-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol?L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.

运用压电石英晶体生物传感器检测产气荚膜梭菌α毒素的实验研究

目的研究运用压电石英晶体生物传感器对产气荚膜梭菌α毒素(CPα)进行检测的方法和反应条件。方法按照碱基配对的原则,设计特异的产气荚膜梭菌α毒素基因寡核苷酸探针并利用巯基自组装技术固定在石英晶体上,运用压电石英晶体生物传感器的"质量效应"对聚合酶链反应(PCR)扩增得到的产气荚膜梭菌α毒素靶基因进行杂交检测,并探讨不同pH值和不同离子强度的缓冲液对检测的影响。结果压电石英晶体生物传感器成功检测出产气荚膜梭菌α毒素;pH7.6的缓冲液和0.64mol/L的NaCl溶液最适合于检测。结论压电石英晶体生物传感器能够有效地检测产气荚膜梭菌α毒素,有望对临床上开展毒素诊断提供一种新的手段。

腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1.2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI/EcoRI和BamHI/EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPA1中含有α毒素全基因。随后用NcoI/EcoRI酶切质粒pXCPA1,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXA1,经NcoI/EcoRI和BamHI/EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXA1)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的16.28%。

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1194bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NcoⅠ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET-28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET-28a-CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

对产气荚膜梭菌 α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理。

产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立产气荚膜梭菌α毒素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体为检测抗体,建立了检测α毒素的DAS-ELISA。通过优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。采用该方法测定产气荚膜梭菌α毒素的最低检测限为0.353倍的小鼠LD_(50),可定量范围为0.353~90.368倍小鼠LD_(50)。结果表明该DAS-ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可以用于大批量样品检测。初步应用结果显示:患产气荚膜梭菌病的兔群肠内容物中产气荚膜梭菌的α毒素水平显著高于健康兔群(p<0.05)。本研究检测α毒素的DAS-ELISA建立有助于畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究。

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的表达

将 2种抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 ( Sc Fv)基因 Sc Fv-2 E3和 Sc Fv-1 A8克隆至表达载体p UC1 1 9、p HOG2 1和 p ET2 0 b中 ,构建了重组质粒 p UC2 E3和 p UC1 A8、p HOG2 E3和 p HOG1 A8、p ET2 E3和 p ET1 A8后 ,分别转化至受体菌 JM1 0 5、JM1 0 9和 BL2 1 ( DE3 )中 ,得到重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)、JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)及 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 )( p ET1 A8)。 ELISA检测表明 ,经 IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)及 JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)的菌培养上清中 ,在重组菌株 BL 2 1 ( DE3 )( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的胞周质中检测到了 Sc Fv的存在。 SDS-PAGE和薄层扫描分析表明 ,重组菌株 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 0 .9%和 0 .7%,其大小约为 2 60 0 0 ,且表达的目的蛋白具有中和磷脂酶 C的活性。

A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的高效表达

将含Ａ型产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经电泳分离、透析袋电洗脱法回收了０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段进行连接、转化。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切分析和序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有α毒素基因，且具有正确的阅读框架。构建的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）能表达α毒素，但已经完全丧失其毒性。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析，ＩＰＴＧ诱导后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）所表达的目的蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和免疫试验结果表明，表达产物能被α毒素抗血清识别，且免疫小鼠后，用强毒株培养上清攻击，结果免疫小鼠能抵抗至少４ＬＤ１００的攻击，这说明表达产物具有良好的免疫原性。

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆和表达

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出抗体VH 和VL 基因 ,连接成ScFv基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中构建了重组质粒pXScFv 2E3。经序列分析证实 ,VH 和VL 基因及linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 6bp ,编码 2 42个氨基酸。随后将其定向克隆于表达载体pHOG2 1,转化至大肠杆菌XL1 BLUE筛选出表达菌株XL1 BLUE(pHOG 2E3)。经ELISA和SDS PAGE分析表明 ,在2 0℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %。

A型产气荚膜梭菌α-毒素基因的克隆与核苷酸序列分析

利用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从A型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了 1.2kb的α毒素基因。通过T4 DNA连接酶 ,将纯化的PCR产物与载体pGEM -T连接 ,转化至受体菌JM10 9中。经NcoI EcoRI和BamHI EcoRI双酶切分析 ,证明重组质粒pXCPA0 2中含有A型产气荚膜梭菌α毒素全基因。经核苷酸序列分析 ,明确了克隆的α毒素基因在重组质粒中的连接向位且核苷酸序列是正确的。

羊魏氏梭菌PCR方法的建立及初步应用

根据羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了羊魏氏梭菌PCR检测方法。该方法扩增条带大小为255bp,最低核酸检测量A型为0.39ng/L、B型为0.62ng/L、C型为0.52ng/L、D型为0.87ng/L、E型为0.92ng/L,而对羊大肠杆菌、羊链球菌、金黄色葡萄球菌、羊多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。应用该PCR方法对54份临床样本进行检测,PCR检测结果高于细菌学和生化检测结果。结果表明,该PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床羊魏氏梭菌病的早期快速诊断。

不同培养条件对抗α毒素ScFv基因表达的影响

将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对ScFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）在LB培养基中加入0.5mmol/L IPTG和 0.4 mol/L蔗糖,37℃诱导6h,其目的蛋白的表达量较高,表达的ScFv蛋白主要以包含体的形式存在,分子量为31,000D,在重组菌株的培养上清和菌体裂解上清液中,通过ELISA法也检测到了ScFv的存在,且具有中和α毒素的活性。