Alpha-bisabolol逆转ABCB1介导的肿瘤多药耐药及机制

目的研究alpha-红没药醇(alpha-bisabolol)是否能有效逆转ATP结合盒转运体B1(ABCB1)介导的肿瘤多药耐药(MDR)并探讨其机制。方法应用网络药理学技术分析仙鹤草(Agrimonia Eupatoria)的活性成分,预测其靶基因,并进行基因本体论(GO)与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。进一步通过分子对接及热稳定性实验分析alpha-bisabolol和ABCB1的互作。通过MTT法检测alpha-bisabolol能否有效逆转ABCB1介导的肿瘤MDR。通过Western blot法、免疫荧光与流式细胞术研究alpha-bisabolol逆转ABCB1介导肿瘤MDR的机制。结果网络药理学实验结果表明,Agrimonia Eupatoria的活性成分alpha-bisabolol与肿瘤的发生密切相关。分子对接及热稳定性实验结果显示,alpha-bisabolol能够与ABCB1形成稳定的结合。逆转实验结果表明,alpha-bisabolol能够有效逆转ABCB1介导的肿瘤MDR。此外,机制实验结果显示,alpha-bisabolol对肿瘤细胞内ABCB1蛋白的表达及定位并不产生影响。alpha-bisabolol通过抑制ABCB1蛋白的外排功能,提高了细胞内药物的蓄积水平,从而有效逆转肿瘤MDR。结论alpha-bisabolol能够有效逆转ABCB1介导的肿瘤MDR,为化疗耐药的肿瘤患者提供了一种新的治疗策略。

鸭疫里默氏杆菌ATP合成酶F1亚单位α亚基的部分生物学特性研究

为筛选和鉴定鸭疫里默氏杆菌(RA)的感染相关蛋白,本研究采用血清1型RA CH3株活菌和灭活菌体免疫鸭的阳性血清分别与血清2型Th4株的全菌蛋白进行交叉免疫蛋白质组学分析,结果表明ATP合成酶F1亚单位α亚基(ATP-F1-α)、Gro EL蛋白和TPR repeat-containing protein等的抗体仅存在于活菌免疫鸭的血清中,推测其可能为感染相关的交叉性抗原;而Tbd R1的抗体在活菌和灭活菌免疫鸭的血清中均存在。利用自杀质粒同源重组的方法构建了ATP-F1-α的基因缺失株,并将其与野生株CH3的生长曲线进行比较。结果表明,缺失株菌体形态与野生株相似,但其在TSB培养基中的生长几乎停滞。以上结果表明RA ATP-F1-α既是一种交叉抗原,又与细菌的生长相关。

P2X受体对豚鼠胃窦环行肌自发性收缩运动的影响

目的:探讨P2X受体激动剂α,β-methylene ATP (α,β-MeATP)对豚鼠胃窦环行肌运动的影响及其离子通道机制.方法:采用EWG/B豚鼠,制备去黏膜胃窦环行肌条(10×1.5 mm),并将其固定于恒温灌流槽内(37℃),用碳酸氢钠缓冲液连续灌流并通氧(950 mL/L O_2,50 mL/L CO_2).利用SMUP-E生物信号处理系统记录胃窦平滑肌自发性收缩活动,Ⅱ型胶原酶消化法分离豚鼠胃窦环行肌单细胞,传统全细胞膜片钳技术记录急性分离的胃窦平滑肌细胞膜电位和离子电流,包括钙激活钾电流、延迟整流型钾电流及电压依赖性钙电流.结果:嘌呤能P2X受体激动剂α,β-MeATP明显抑制豚鼠胃窦环行肌自发性收缩,并有明显的量效倚赖关系:5,10,20,40,100μmol/Lα,β-MeATP作用下,环行肌收缩幅度分别由对照组的100%下降到90%±2%.81%±4%,68%±4%,59%±7%和29%±4%(P<0.05).用神经阻断剂Tetrodotoxin (TTX)预处理后,α,β-MeATP对胃窦环行肌自发性收缩的抑制作用仍不受影响;在传统全细胞膜片钳电流钳模式下,500μmol/Lα,β-MeATP不影响细胞膜电位,也对两种外向钾电流,即延迟整流型钾电流和钙激活钾电流没有影响;不同浓度的α,β-MeATP对电压依赖性钙电流没有影响.结论:P2X受体激动剂抑制豚鼠胃窦环行肌自发性收缩,其作用机制不依赖内在神经,也不依赖细胞膜离子通道以及膜电位改变.

肺炎衣原体抑制LXRα-ABCA1途径促进巨噬细胞脂质蓄积

为探讨肝X受体α(LXRα)-三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)途径在肺炎衣原体(C.pneumoniae)促巨噬细胞脂质蓄积中的作用和机制,以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为模型,采用高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量,液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出,RT-PCR检测ABCA1和LXRαm RNA的表达,蛋白质印迹检测ABCA1和LXRα的蛋白质表达;使用LXRα的特异性激动剂T0901317对细胞进行预处理,再观察上述指标的变化.结果显示,C.pneumoniae可促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量增加,抑制胆固醇外流,降低细胞ABCA1和LXRα的表达;使用ABCA1激动剂8-溴-环磷酸腺苷预处理细胞或LXR激动剂T0901317预处理细胞后,可明显减弱C.pneumoniae对THP-1细胞ABCA1的表达抑制,促进细胞胆固醇流出,降低细胞内胆固醇的含量.结果提示,C.pneumoniae促进巨噬细胞脂质蓄积及胆固醇流出障碍,其机制可能与LXRα-ABCA1途径有关.

烟酸对小鼠体内胆固醇逆转运的影响及其机制

目的观察烟酸干预后对小鼠体内胆固醇逆转运的影响,并探讨其机制。方法14只C57BL/6小鼠随机分为两组,分别给予普通饲料、烟酸添加饲料喂养4周后,腹腔注射经乙酰化-低密度脂蛋白及3H-胆固醇处理过的小鼠巨噬细胞悬液(0.5mL/鼠,细胞数为5.0×106),单独笼养24h后测定粪便中的3H-胆固醇含量(占注射总量的百分比);逆转录聚合酶链反应测定小鼠肝脏和小肠三磷酸腺苷结合盒转运体G5、肝X受体α mRNA及肝脏胆固醇7α羟化酶mRNA表达并用Western blot印迹检测肝脏和小肠的三磷酸腺苷结合盒转运体G5和肝X受体α蛋白表达。结果与对照组比较,烟酸组小鼠肝脏和小肠的三磷酸腺苷结合盒转运体G5、肝X受体α,肝脏胆固醇7α羟化酶mRNA水平和肝肠的三磷酸腺苷结合盒转运体G5、肝X受体α蛋白质水平均增高,粪便中的胆固醇流出率增加21%。结论烟酸可能通过上调体内肝X受体α,从而刺激三磷酸腺苷结合盒转运体G5、胆固醇7α羟化酶表达来发挥促进小鼠体内胆固醇逆转运作用。

妊娠高血压综合征患者血小板功能的研究

目的探讨妊娠高血压综合征(妊高征)患者血小板聚集(PAgT)、释放试验及血小板α-颗粒膜蛋白(GMP- 140)的测定及其临床意义。方法应用阻抗法与荧光法同步测定 PAgT 及 ATP 释放反应；应用 ELISA 法测定血浆中血小板 GMP-140。结果妊高征患者 PAgT、ATP 释放量及血浆 GMP-140含量较正常非孕组明显升高,差异有统计学意义(P＜ 0.05或 P＜0.01)；与正常晚孕组比较,妊高征各组患者 PAgT、血浆 GMP-140含量活性显著增高(P＜0.05或 P＜0.01),且病情越重增高越明显；而 ATP 释放量在晚孕组及妊高征各组则无明显差异。轻、中、重度妊高征 PAgT 与血浆 GMP-140含量水平呈直线正相关关系(r=0.653,P＜0.05；r=0.737,P＜0.05；r=0.778,P＜0.01)。结论妊高征患者由于血小板处于过度活化状态,引起凝血功能亢进,可能是导致妊高征发病和引起临床症状的原因之一。

糖尿病患者血小板聚集、释放试验及血小板活化分子标志物测定的临床意义

目的探讨糖尿病患者血小板聚集、释放试验及血小板α-颗粒膜蛋白(GMP-140)的测定及临床意义。方法应用阻抗法与荧光法同步测定血小板聚集及ATP释放反应;应用ELISA法测定血浆中血小板α-颗粒膜蛋白(GMP-140)。结果糖尿病患者血小板聚集功能、ATP释放量及血浆GMP-140含量较正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);糖尿病有并发症组与无并发症组比较,血小板聚集功能、血浆GMP-140含量差异亦有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且病情越重增高越明显;而ATP释放量则无明显差异。糖尿病有并发症组与无并发症组血小板聚集功能及血浆GMP-140含量水平呈直线正相关关系(r2=0.653,P<0.05;r2=0.471,P<0.05)。结论糖尿病患者血小板处于过度活化状态,引起凝血功能亢进,可能是导致糖尿病发病和引起并发症的原因之一。测定血小板聚集试验和血浆中GMP-140含量的水平,及时发现血小板功能状态的改变,对于指导糖尿病的临床诊断及治疗具有重要意义。

体外多巴胺转运体（DAT）介导6-羟多巴的细胞毒性作用

6-羟多巴（6-OHDA）被广泛用于制作Parkinson’8疾病（PD）动物模型，并可以选择性的破坏黑质纹状体系统。但是6-OHDA在体外对多巴胺能细胞的选择性毒性作用目前还存在争议。根据多种体外毒性试验结果，alpha-synuclein突变体（A30P和A53T）可以引起细胞的脆性增加，并增加多巴胺转运体（DAT）介导的选择性多巴胺能神经毒素和线粒体复合物Ⅰ抑制剂MPP的毒性作用。德国Ulm大学的Lehmensiek V等人为了阐明6-OHDA的选择性多巴胺能毒性作用机理，研究了DAT介导的毒性作用。作者选用的是能共表达人DAT蛋白和Mpha-synucleins突变体的人胚胎肾HEK-293细胞用于研究6-OHDA的毒性作用机制。6-OHDA在没有Mpha—synucleins突变体表达的HEK—hDAT细胞中24小时后的半数毒性作用（TC（50））为88muM，该值在表达A30P和A53TMpha—synuclein突变体的细胞中分别减少到58和39muM。但alpha—Synuclein突变体在6-OHDA对没有表达DAT的HEK-293细胞作用中没有影响。细胞能量代谢的细胞内参数分析提示HEK—hDAT细胞共表达Mpha—synucleins突变体可加速由于6-OHDA所致的细胞内ATP水平和ATP／ADP比率的降低。

达格列净通过改善线粒体功能减轻2型糖尿病小鼠及高糖诱导的血管内皮细胞损伤

目的:探讨达格列净对2型糖尿病小鼠胸主动脉内皮细胞损伤及高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的抑制作用及其分子机制。方法:(1)将20只2型糖尿病db/db小鼠随机分为模型组和达格列净组,另取10只正常db/m小鼠作为对照组。饲养40 d后麻醉处死,迅速摘取眼球取血,分离血清,并收集胸主动脉组织。HE染色观察胸主动脉组织形态学改变,Western blot法检测小鼠胸主动脉组织中ATP合酶α亚基(ATP5A1)、内皮素1(ET-1)和前列环素(PGI_(2))蛋白表达水平。(2)将HUVECs分为对照组、DMSO组、高糖组和高糖+达格列净组;采用活性氧(ROS)荧光探针和线粒体ATP荧光探针检测HUVECs中ROS及线粒体ATP荧光强度;采用免疫细胞化学和Western blot检测HUVECs中ATP5A1、ET-1和PGI_(2)蛋白表达水平。结果:达格列净可显著减轻db/db小鼠胸主动脉组织损伤;与高糖组相比,达格列净治疗后HUVECs中ROS荧光强度显著降低,线粒体ATP荧光强度显著升高(均P<0.01);免疫细胞化学和Western blot结果显示,达格列净治疗后ATP5A1和PGI_(2)蛋白表达水平显著升高,ET-1蛋白表达水平显著降低(均P<0.01);ATP5A1过表达质粒转染后,HUVECs中ATP5A1和PGI_(2)蛋白表达水平显著升高,ET-1表达水平显著降低(均P<0.01)。结论:达格列净减轻2型糖尿病小鼠胸主动脉内皮细胞损伤及高糖诱导的HUVECs损伤,其机制可能与调控ATP5A1表达、改善线粒体功能有关。

肿瘤坏死因子-α对泡沫细胞胆固醇流出及ATP结合盒转运子A1表达的影响

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对泡沫细胞胆固醇流出途径的影响及可能作用机制。方法采用人组织瘤细胞-1(THP-1)细胞诱导分化形成的泡沫细胞,测定 TNF-α与细胞胆固醇流出的时间、浓度关系。然后给予饱和浓度的 TNF-α刺激,随机将泡沫细胞分成对照组、TNF-α组、对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲基甲酮(N-α-tosyl-L-phenylalanine chloromethy ketone,TPCK)组及TPCK+TNF-α组,以 RT-PCR 法、Western blot 法测定细胞 ATP 结合盒转运子 A1(ABCA1)的表达。结果 TNF-α抑制细胞胆固醇流出呈时间、浓度效应,在10.0ng/ml 时,TNF-α抑制胆固醇流出达到饱和效应。10.0 ng/ml TNF-α刺激后以时间依赖方式下调 ABCA1表达。TPCK 预孵育后可部分逆转 TNF-α对 ABCA1表达的下调。结论炎症因子 TNF-α可通过抑制 ABCA1的表达而减少细胞胆固醇的流出,核因子_KB(NF-_KB)激活抑制剂 TPCK 可逆转 TNF-α的上述影响,提示 TNF-α抑制 ABCA1表达与 NF-_KB 激活有关。TNF-α/NF-_KB 信号途径可抑制泡沫细胞的胆固醇流出,从而加重细胞内胆固醇的蓄积。

淡豆豉异黄酮通过PPARγ/LXRα/ABCA1信号通路改善动脉粥样硬化小鼠脂质代谢的作用

目的:通过卵巢切除结合高脂饲料喂养制备动脉粥样硬化小鼠模型,观察淡豆豉异黄酮(ISSP)对小鼠脂质代谢的影响,并从调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ/肝X受体α/腺苷三磷酸结合盒转运体A1(PPARγ/LXRα/ABCA1)信号通路的角度进一步探讨其作用机制。方法:将50只载脂蛋白E敲除(ApoE^(-/-))小鼠随机分为模型组、西药组(阿托伐他汀钙,3.03 mg·kg^(-1))、中药低、中、高剂量组(淡豆豉异黄酮,2.5、5、10 mg·kg^(-1)),每组10只,以手术切除双侧卵巢同时喂食高脂饲料的方法制备动脉粥样硬化模型小鼠,另取10只ApoE^(-/-)小鼠,以手术切除卵巢旁脂肪同时喂食高脂饲料的方法作为假手术组,其中部分小鼠因术后感染死亡,最终确定每组为6只小鼠,术后1周开始各组灌胃相应药物或等量生理盐水。12周后检测血清及肝脏组织中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(NEFA)的含量;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的含量;苏木素-伊红(HE)及油红O染色观察主动脉斑块形成及肝脏脂质沉积情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1 mRNA及蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C、TNF-α及IL-6含量显著升高(P<0.01),HDL-C水平显著降低(P<0.01);肝脏指数明显升高(P<0.05),肝脏脂肪空泡明显,脂质沉积显著,肝脏中TC、TG、NEFA含量显著增多(P<0.01);肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),ABCG1 mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,服用阿托伐他汀钙和淡豆豉异黄酮中、高剂量组可使小鼠血清TC、TG、LDL-C、TNF-α和IL-6含量显著降低(P<0.01),HDL-C水平显著降低(P<0.01);肝脏指数显著降低(P<0.01),肝脏脂肪空泡及脂质沉积显著减少,肝脏中TC、TG、NEFA含量明显增多(P<0.05,P<0.01);肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1和ABCG1 mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01)。结论:淡豆豉异黄酮可能通过PPARγ/LXRα/ABCA1信号通路调节脂质代谢,减少血清炎症表达及肝脏脂质沉积从而改善动脉粥样斑块的形成。