α-苦瓜素基因的克隆和原核表达

α-苦瓜素(Alpha-momorcharin)是一种多功能核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤、抗HIV-1和抗菌活性,并同时具有免疫抑制活性。利用PCR(polymerase chain reaction)技术从苦瓜基因组中扩增出了成熟的α-苦瓜素蛋白基因,并亚克隆到表达载体pET28a(+)上,然后分别在BL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中进行表达。结果表明只在RosettaTM(DE3)pLysS中,重组α-苦瓜素基因能成功地表达出33kD大小的重组蛋白,而且在18℃和22℃的温度下,经IPTG诱导后,能成功地表达出大量可溶性重组蛋白。利用重组蛋白的N末端带有的6×His标签,通过Ni-NTA柱纯化获得了α-苦瓜素重组蛋白。Western杂交实验表明,纯化后的重组蛋白可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应。α-苦瓜素重组蛋白的获得为进一步系统研究和改造其功能与活性奠定了基础。

苦瓜籽α-苦瓜素的分离纯化及其生物活性的研究

目的建立一种快速、高效制备α-苦瓜素的方法 ,并初步研究其部分生物活性。方法用硫酸铵分级沉淀、SP-Sepharose FF离子交换层析、Sephacryl S-100分子筛层析以及Macrocap SP离子交换层析等方法 ,从苦瓜籽中纯化出苦瓜蛋白(α-MMC);通过MTT实验,研究了α-MMC的抗肿瘤活性;测定HepG2.2.15 cell的培养上清液中HBsAg和HBeAg的含量,研究了α-MMC的抗HBV活性。结果与结论α-MMC具有抑制HBV和肿瘤细胞增殖的作用,呈时效和量效依赖性。

聚乙二醇修饰对α-苦瓜素抗肿瘤活性的影响

目的探讨苦瓜籽核糖体失活蛋白α-苦瓜素(α-MMC)经聚乙二醇(PEG)修饰后,其体外细胞毒性和体内抗肿瘤活性的变化。方法用MTT法测定α-MMC和PEG-α-MMC结合物对小鼠乳腺癌细胞EMT-6的抑制率;通过BALB/C小鼠模型研究药物对EMT-6细胞嫁接瘤生长的抑制作用。结果在相同的条件下,PEG-α-MMC结合物对体外培养的EMT-6细胞生长抑制效果相对α-MMC降低了30%,且两者对肿瘤细胞的毒性呈剂量和时间依赖性。PEG-α-MMC结合物的体内抗肿瘤活性比相同剂量的α-MMC增加约10%,且两者对肿瘤生长的抑制作用呈剂量依赖性。结论α-MMC经PEG修饰后,其体外抗肿瘤活性显著减低,而体内抗肿瘤活性增高,预示PEG-α-MMC结合物具备更好的抗肿瘤潜能。

α-苦瓜素蛋白的原核表达及其抗体制备

α-苦瓜素是一种典型的Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有多种生物活性,有着广泛的应用前景。本研究通过原核表达技术成功获得α-苦瓜素蛋白及制备了血清抗体。首先通过RT-PCR方法从苦瓜籽中克隆到α-苦瓜素全长基因,然后将该基因连接至原核表达载体p ET-28a(+)上,导入大肠杆菌Rosetta菌株中并少量诱导表达,筛选出重组蛋白的最适表达条件。在37℃、终浓度1 mmol/L IPTG的诱导条件下,可成功诱导出分子量约为29.7 k D左右的可溶性重组蛋白,与预期α-苦瓜素大小一致。按照最适条件进行大量诱导α-苦瓜素蛋白的表达,利用Ni-NTA柱对α-苦瓜素重组蛋白进行纯化,最后以纯化的α-苦瓜素蛋白免疫注射新西兰大白兔制备抗血清。Western blotting分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测苦瓜籽中的α-苦瓜素蛋白。本研究结果为下一步探究α-苦瓜素调控植物防御生物胁迫的分子机理提供指导。