牛奶中喹诺酮类药物残留的AlphaLISA检测方法的研究

本文旨在建立一种可检测牛奶中喹诺酮类药物(Quinolones,QNS)残留的均相光激化学发光免疫分析方法(Amplifiedluminescent proximity homogeneous assay linkedimmune sorbent assay,AlphaLISA)。采用EDC/NHS活泼酯法在诺氟沙星分子连接6-氨基己酸作为间隔臂,制备生物素修饰诺氟沙星半抗原(Biotin-6AS-NOR),并在受体微球上偶联QNS单克隆抗体,Biotin-6AS-NOR可与牛奶样品中的QNS竞争结合喹诺酮抗体;通过优化受体微球的QNS抗体偶联量,Biotin-6AS-NOR及供/受体微球的用量等参数,以及牛奶样品的稀释方案,建立了牛奶中QNS残留的AlphaLISA检测方法。采用1:5牛奶样品稀释方案,所建立牛奶中QNS残留的AlphaLISA检测方法的检出限和定量限分别为0.19 ng/mL和0.46 ng/mL,回收率在85.97%~110.11%之间,日内和日间变异系数均小于10%,与诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、达氟沙星和洛美沙星的交叉反应率均高于70%。本研究所建立AlphaLISA检测方法具有灵敏度和准确度高、重复性好等优点,且在整个检测过程中不需要繁琐洗涤操作,具有较高的应用和推广价值。

盐酸克伦特罗的AlphaLISA检测方法的建立

目的：采用纳米均相时间分辨荧光免疫技术(amplified luminescent proximity homogeneous assay, Alpha-LISA)建立高灵敏检测盐酸克伦特罗(clenbuterol, CLB)残留的方法。方法在发光微粒上固定 CLB,与游离的CLB共同竞争固定在感光微粒上的CLB单克隆抗体,优化检测条件并进行方法学考核。结果该方法的灵敏度为0.04 ng/mL。猪肉样品回收率在83%~109%之间,牛肉样品回收率在92%~112%之间；猪肉样品检测的批内变异系数CV<10%、批间变异系数CV<15%。与特布他林、沙丁胺醇的交叉反应率分别为34.5%、25.7%,与莱克多巴胺、妥布特罗、齐帕特罗无交叉反应。结论 CLB-AlphaLISA 检测肉类中克伦特罗残留具有简单、快速、灵敏性高、特异性强、稳定等特点,具有广阔的应用前景。

AlphaLISA方法测定抗白介素-17受体单抗生物学活性

目的:利用AlphaLISA方法建立抗白介素-17受体单抗的生物学活性测定方法。方法:以人包皮成纤维细胞系作为靶细胞,通过AlphaLISA检测系统建立抗IL-17R单抗的生物学活性测定方法,根据四参数拟合分析计算抗IL-17R单抗的相对效价,并对该方法进行了验证。结果:抗IL-17R单抗在该方法中存在量效关系,并且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D。6批抗IL-17R单抗经3次测定,相对效价平均值在(84.93±3.12)%^(107.51±1.66)%,相对标准偏差小于5%。2批回收率样品经3次测定,回收率分别为(100.66±13.65)%和(115.69±3.85)%。结论:本研究利用AlphaLISA方法在国内首次成功建立重复性好、准确性高的抗IL-17R单抗的生物学活性测定方法。

猪肉中β-受体激动剂AlphaLISA检测方法的建立

建立了快速检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林4种β-受体激动剂的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫(Alpha LISA)分析方法。样品经乙酸铵和β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶酶解提取过柱,浓缩至干后,用缓冲溶液定容。样品与生物素化抗原、抗体、供体微珠和受体微珠进行酶联免疫,Alpha LISA进行检测,基质标准曲线定量。结果表明:沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗和特布他林在0.1~500ng/m L范围内呈良好线性,相关系数均大于0.98,沙丁胺醇与克伦特罗、溴布特罗和特布他林的交叉反应率分别为143.3%,179.2%和95.6%,检出限为0.03~0.08 ng/m L。在0.5,10,20μg/kg 3个添加水平下,4种化合物的平均回收率为82.5%~115.9%,相对标准偏差(RSD)均小于12.0%。该方法操作简单,快速准确,适用于猪肉中β-受体激动剂的筛选与检测。

水产品中孔雀石绿AlphaLISA检测方法的建立

建立孔雀石绿(malachite green,MG)的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫法(AlphaLISA)分析方法。将待测物,生物素化-MG-BSA,抗体加入到孔板中,再加入供体微珠和受体微珠。生物素化-MG-BSA和游离的待测物对抗体的竞争使得信号值减小,从而优化检测条件并进行方法学验证。结果表明:该方法特异性良好,与无色孔雀石绿,无色结晶紫无交叉反应,灵敏度为0.42 ng/m L,MG在2种鱼样品中的回收率在81.0%~105.0%和84.0%~90.8%之间,批内精密度RSD<9.5%,批间精密度RSD<16.0%。MG-AlphaLISA方法可以简单、快速的对鱼类进行MG测定,具有特异性强、灵敏性高、稳定等特点。

AlphaLISA法同时测定动物组织中克伦特罗和莱克多巴胺

目的:建立同时测定动物组织中克伦特罗(clenbuterol,CLB)和莱克多巴胺(ractopamine,RAC)的纳米均相时间分辨荧光免疫(amplified luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbent assay,AlphaLISA)分析方法。方法:样品经β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酯酶和乙酸铵酶解提取,正己烷脱脂,滤膜过滤,滤液与生物素化抗原、抗体、供体微珠和受体微珠进行酶联免疫,AlphaLISA进行检测。结果:CLB和RAC在0.1~50 ng/mL范围内呈良好的线性关系(R2>0.98),检测限为0.02 ng/mL;在5、10、20μg/kg 3个添加水平下CLB+RAC(1∶1)、CLB和RAC的回收率分别为88.8%~102.8%、86.6%~98.3%和84.2%~103.2%;相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于12%。结论:该方法快速简单、结果准确可靠,适用于检测和筛选动物组织中的RAC和CLB。

牛乳制品中青霉素酶Alphalisa的检测方法

建立牛乳制品中青霉素酶Alphalisa的检测方法。将青霉素酶进行生物素化,与样品中的青霉素酶竞争结合鼠源性青霉素酶单克隆抗体,利用Alphalisa反向竞争的反应模式,对牛乳中的青霉素酶实施检测。建立的Alphalisa检测方法能特异性识别样品中存在的青霉素酶,方法的线性范围在2.5-500 IU/mL;检出限和定量限分别为1.6 IU/mL和5 IU/mL;批间批内变异度均小于10%。结果表明,该方法能够替代传统酶联免疫吸附实验方法,成为青霉素酶的实验室筛查或检测方法。

AlphaLISA法检测乙型肝炎病毒X蛋白方法学的建立

目的建立新型的均相检测技术AlphaLISA(Amplifed Luminescent Proximity Homogeneous Assay)法,检测原发性肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)病人石蜡包埋切片组织(Formalin-fixed and paraffin-embedded tissue,FFPE)中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)。方法采用针对HBx蛋白不同表位的两种单克隆抗体X36C和3F6-G10,将其中一种抗体X36C与受体微珠(Acceptor Beads)连接,另一种抗体3F6-G10生物素化,再将HCC病人FFPE总蛋白提取液、供体微珠(Donor Beads)及上述两种处理后的抗体在23℃共同孵育90min后,用EnSpire2300多功能酶标仪检测信号值。结果 FFPE蛋白提取液检测信号值为4667,HBx蛋白标准品检测信号值为3606;FFPE蛋白提取液样本对照、试剂对照1(Bio-3F6-G10+Acceptor-X36C+Donor Beads)、试剂对照2(buffer)的信号值分别为5、823、79;当生物素化抗体浓度为0.1625nM时,HBX检测信号达到最大峰值,即AlphaLISA出现Hooking Effect;AlphaLISA法检测HBX阈值下限为5pg。结论本实验成功建立了AlphaLISA法,用于检测HCC病人FFPE中的HBX。实验操作过程简单快捷,敏感性高于传统的ELISA技术。

AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素E方法的建立

目的:利用AlphaLISA技术,建立新型均相检测方法,对金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)进行检测。方法:采用2种SEE抗体建立AlphaLISA检测方法,羊抗肠毒多克隆抗体同受体微球偶联,SEE小鼠单克隆抗体标记生物素,并同偶联了亲和素的供体微球连接,3种组分与待测抗原形成双抗体夹心结构,680nm的光激发供体微球产生能量,将周围反应体系中的氧分子转变为激发态,并将能量传递给受体微球,产生520~620nm的荧光,荧光信号与抗原浓度正相关。对该方法的反应体系进行优化,验证其重复性、敏感性和特异性,并采用该方法检测菌液上清和食品模拟样本。结果:所建立的AlphaLISA检测方法重复性较好,批间变异系数和批内变异系数皆小于10%;检测SEE的灵敏度可以达到100pg/mL,并与其他几种毒素均无交叉反应,具有较好的特异性。该方法也能够准确地对金黄色葡萄球菌菌液上清中的SEE进行检测,对食品模拟样本的检测也有较好的灵敏度。结论:建立了检测SEE的AlphaLISA方法。该方法均相免洗,操作便捷,用时短,灵敏度更高,可对菌液上清和不同食品模拟样本中的SEE进行检测。

Determination of Interaction between NFκB p50 and <i>β</i>-IFN-<i>κ</i>B Binding Oligo Using AlphaLISA in HTP Fashion

NF-κB plays a crucial role in regulating various biological processes including innate and adaptive immunity, inflammation, stress responses, B-cell development, and lymphoid organogenesis. Currently, several assays like electrophoretic mobility shift assay (EMSA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) are widely used for studying the NFκB intraction with β-IFN-κB binding oligo. Each of these techniques has varying utility with distinct strengths and weaknesses. We describe a method AlphaLISA to identify NFκB p50 protein and β-IFN-κB binding oligo sequence and interaction is efficient at a given concentration (10 nM) in the EMSA and Biacore’s SPR assays. The method has many advantages such as use of small volume, high throughput (HTP), convenience of sample preparation and data analysis.

AlphaLISA技术的发展及应用

AlphaLISA技术是一种基于微珠的化学发光的新型均相检测技术,与传统的ELISA技术相比具有更高的敏感性、精确性、均一性、背景低、广泛的动态检测范围,而且无需洗涤及样本需求量极少等特点.该技术可用于多种组织、细胞来源的生物分子的检测,如细胞因子、抗原抗体的检测、蛋白相互作用及蛋白质与核酸相互作用的检测以及药物分析等研究.随着AlphaLISA技术的发展,该技术已在医学及分子生物学领域得到了广泛的应用.

呼吸道合胞病毒IgM抗体AlphaLISA快速检测方法的建立

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属于副粘液病毒科,是一种下呼吸道感染最主要的RNA病毒。呼吸道合胞病毒感染是引起全球婴幼儿高致死率的呼吸道感染病原,仅次于疟疾,但用于检测RSV感染的选择相对较少。本文通过抗原抗体结合原理,建立呼吸道合胞病毒(RSV)IgM抗体AlphaLISA快速检测方法。小鼠抗人IgM单克隆抗体偶联的受体微球与临床血清样品中RSV特异性IgM抗体结合,RSV特异性IgM抗体再与生物素标记的RSV抗原结合,生物素连接偶联链霉亲和素的供体微球;受体微球和供体微球的距离被拉近小于200nm,680nm荧光激发供体微球生成单线态氧,扩散给受体微球,发射波长为520~620nm的荧光,荧光强度与血清中RSV特异性IgM抗体呈正比。结果显示,该方法批内变异系数与批间变异系数均小于10%,不与其他呼吸道病原体发生交叉反应,与间接免疫荧光法具有较好的一致性,总符合率达83.33%。该方法具有微量检测、快速省时、操作简便等优势,可快速检测RSV的IgM抗体,为早期确诊RSV感染提供高效可行方案。

AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素A方法的建立

目的建立一种快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的均相光激化学发光免疫分析法(AlphaLISA)。方法待测样本中的SEA与偶联有羊抗SEA多克隆抗体的受体微球、生物素化的小鼠抗SEA单克隆抗体发生反应,形成双抗体夹心结构,再与包被链霉亲和素的供体微球形成复合体。680 nm波长荧光激发供体微球上的光敏剂产生单线态氧,触发受体微球发出615 nm波长荧光,多功能酶标仪检测信号值,信号值高低与待测样本中SEA的浓度呈正比。结果缓冲液中SEA的最低检出限(LOD)为0.1 ng/ml,线性范围0.2~50 ng/ml,相关系数R2为0.9941。检测体系不易受高糖、高盐和高蛋白等样本基质的影响,牛乳等液态模拟样本和10%(w/v)稀释的奶粉、豆干、火腿肠等固态食品模拟样本的LOD均为0.1 ng/ml。检测体系与其他4种肠毒素(SEB、SEC、SED、SEE)、A型肉毒毒素、蓖麻毒素、相思子毒素均无交叉反应,特异性较好。无论是缓冲液还是模拟样本检测,变异系数均小于10%,具有较好的重复性。结论该法操作流程简便,检测灵敏度高、特异性强,检测时间为25 min,在金黄色葡萄球菌性食物中毒的鉴别诊断中具有较好的应用前景。

副流感病毒IgM抗体AlphaLISA快速检测方法建立

副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)是较为常见且广泛的社区性获得性抗原,其感染率仅次于呼吸道合胞病毒。由于PIV感染的临床表现与其他呼吸道病毒感染无特异性差别,所以早期、快速、准确诊断尤为重要。本文建立PIV IgM抗体的AlphaLISA快速检测方法,PIV特异性抗原与待测样品中PIV IgM抗体结合使供体微珠和受体微珠相互接近时,激光激发级联反应,从而产生放大的信号。通过对PIV特异性抗原生物素标记量和稀释比例的摸索,确定最佳反应体系。该方法批内和批间变异系数均小于10%,与间接免疫荧光方法比对,总符合率高于95%,且不与其他7种常见呼吸道病原体的IgM抗体发生交叉反应。AlphaLISA方法操作简便,整个反应过程只需要25 min,可快速检测PIV的IgM抗体,为早期确诊PIV感染提供有效办法。

AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素D

目的利用新型均相化学发光免疫分析技术(AlphaLISA)检测金黄色葡萄球菌肠毒素D(SED),并与传统酶联免疫吸附测定(ELISA)进行比较。方法采用SED单抗偶联发光微球,生物素标记另一SED单抗,以及链霉亲和素偶联感光微球构建SED AlphaLISA检测体系;SED单抗包被,另一生物素标记SED单抗检测,链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶(HRP)放大,构建SED ELISA检测体系。结果与结论确定AlphaLISA发光微球和生物素标记抗体的最适稀释比例为1∶50和1∶1000;确定ELISA包被抗体的最适浓度为3μg/ml,生物素标记抗体和链霉亲和素偶联HRP的最适比例分别为1∶1000和1∶2000;AlphaLISA对缓冲液和牛奶模拟样本SED的检出限为100 pg/ml,变异系数(CV)为0.3%~8.9%;ELISA对缓冲液和牛奶模拟样本SED的检出限为781.29 pg/ml,CV为1.0%~19.8%;两种方法均不与其他型肠毒素抗原产生交叉反应。与ELISA相比,AlphaLISA检测SED灵敏度、精确性更高。

腺病毒IgM抗体AlphaLISA快速检测方法

目的建立一种腺病毒IgM抗体的均相光激化学发光免疫快速检测方法(AlphaLISA)。方法通过筛选小鼠抗人IgM单克隆抗体标记受体微球、链霉亲和素偶联供体微球和生物素化腺病毒抗原的最适比例,构建腺病毒IgM抗体均相AlphaLISA快速检测体系;采用呼吸道感染样品对该检测体系进行评价,并与间接免疫荧光方法比较。结果与结论该法重复性较好,批内和批间变异系数均小于5%,与间接免疫荧光方法相比总符合率为87.21%,且不与其他常见呼吸道病原体的IgM抗体发生交叉反应。该法用于腺病毒IgM抗体的快速检测,可为早期确诊腺病毒感染提供可行方案。

AlphaLISA检测新型冠状病毒

目的建立均相光激化学发光免疫分析方法(AlphaLISA)快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。方法采用新型冠状病毒抗体偶联发光微球,生物素标记另一抗体,以及链霉亲和素偶联感光微球构建新型冠状病毒AlphaLISA检测体系。采用SARS-CoV-2真核表达抗原和灭活病毒对AlphaLISA方法进行评价,并与商业化ELISA试剂盒进行比对。结果确定单抗1#与多抗组别作为新型冠状病毒AlphaLISA检测的抗体对,AlphaLISA对新型冠状病毒抗原的检出限为0.39 ng/ml,具有较好的重复性,批内差1.90%~8.93%,批间差1.75%~9.04%,对不同临床样本的检测具有较好的耐受性,与ELISA试剂盒相比对灭活病毒的检测敏感性更高。结论AlphaLISA可实现对SARSCoV-2的高效快速检测。

牛奶模拟样本中金黄色葡萄球菌肠毒素C含量的两种发光检测方法比较

目的 比较均相光激化学发光检测法(AlphaLISA)和磁微粒化学发光检测法(MP-CLIA)在检测牛奶模拟样本中金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)含量的敏感性和精确性。方法 以山羊抗SEC多克隆抗体偶联受体微球、生物素标记的SEC单克隆抗体和链霉亲和素偶联的供体微球,构建AlphaLISA检测体系;以山羊抗SEC多克隆抗体偶联碱性磷酸酶、生物素标记的SEC单克隆抗体和链霉亲和素偶联磁珠,构建MP-CLIA检测体系。结果 AlphaLISA检测牛奶模拟样本中SEC含量的灵敏度为4.04 ng/L,变异系数(CV)为1.98%~9.82%;MP-CLIA的灵敏度为108.19 ng/L,CV为4.63%~20.40%。结论 与MP-CLIA相比,AlphaLISA检测牛奶模拟样本中SEC含量的敏感性和精确性更高。

纳米均相时间分辨荧光免疫法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇方法的建立

目的:利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)多克隆抗体,采用纳米均相时间分辨荧光免疫法测定技术(AlphaLISA)建立间接竞争DON定量检测方法。方法:DON-BSA包被发光微粒,生物素化羊抗兔抗体与包被有链霉素的感光微粒共同构成检测试剂,优化检测条件并评价检测性能。结果:该方法的灵敏度为0.007ng/mL,检测范围为0.007～100ng/mL,批内批间变异系数均<5%。不同样品添加回收实验:玉米、小麦、啤酒回收率分别为84%～110%、67%～100%、74%～100%。结论:DON-AlphaLISA是目前DON检测中最灵敏的方法之一,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景。

光激化学发光免疫检测探针材料的设计与制备

光激化学发光免疫检测具有无背景荧光干扰、均相免洗的优势,在体外诊断快速检测领域中具有重要的应用前景。然而,该检测技术所用探针材料的稳定可控制备仍是该技术产业化应用的主要难点之一。采用PVP调控的共聚法,制备的负载铕螯合物Eu(DBM)3Phen和硫氧杂环己烯衍生物PCU的聚苯乙烯纳米球作为受体球。采用介孔二氧化硅包覆,制备的负载光敏剂Ce6的Fe_(3)O_(4)@mSiO_(2)纳米球作为磁控驱动的供体球。利用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、能谱仪等手段对受体球和磁控供体球进行表征。结果表明:受体球呈规则球形且尺寸均一,平均粒径约为200 nm,易分散于水,能与单线态氧作用而发光,最大发射波长约为615 nm;磁控供体球呈球形核壳结构,平均粒径约为700 nm,易分散于水中,在波长680 nm光照下能产生单线态氧,可用磁铁分离。分别用兔IgG和羊抗兔IgG修饰磁控供体球和受体球,结果显示两者之间能发生有效的特异性结合,用磁铁分离去除非特异性结合的探针球后,成功测得光激化学发光信号,证明了两种探针材料的成功制备。