南药益智ITS-PCR体系的建立与优化

为了建立适合南药益智的ITS-PCR体系来研究不同地理居群益智遗传多样性,本研究利用植物基因组试剂盒法提取益智基因组DNA为模板,采用单因素和正交试验对ITS-PCR过程中的关键影响因素进行优化,并对ITS-PCR产物进行测序鉴定。实验结果表明最佳ITS-PCR反应体系(25μL)为:Taq酶1.0 U,d NTPs 4 mmol/L,Mg2+0.5 mmol/L,引物2.0μmol/L,模板20 ng,10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5μL;最佳扩增程序为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共32个循环;最后72℃延伸5 min。采用该最佳体系对益智基因组DNA进行PCR扩增,获得扩增产物经单向测序获得了益智ITS部分序列。建立了稳定的ITS-PCR体系,为研究益智遗传多样性分析奠定了基础。

益智ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的:获得适合的益智ISSR-PCR扩增反应体系。方法:利用正交设计L16(45)和单因素试验对益智ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTPs,引物)在4个水平上进行优化试验,将二者所得结果进行综合比较分析。结果:最终获得益智ISSR-PCR反应的最优体系(20μl)为:模板DNA100ng,Mg2+3.0mmol/L,引物0.8μmol/L,dNTPs0.25mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U。最后,对益智ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为50℃。结论:这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术研究分析益智遗传多样性奠定基础。