链格孢ATMT转化体系的构建及弱毒突变株验证

本文利用来自质粒pUCATPH的构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子(PtrpC)、终止子(TtrpC)和潮霉素磷酸转移酶抗性基因(hph)以及植物表达载体pROKⅡ成功构建了适用于丝状真菌的根癌农杆菌介导转化的双元载体pROKIIHPH,并转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404,建立了根癌农杆菌LBA4404介导的链格孢Alternaria alternata分生孢子转化体系;再从乙酰丁香酮(AS)浓度、不同的共培养时间、受体菌分生孢子浓度和农杆菌菌液浓度对A. alternata转化效率的影响对体系进行优化。结果确定了根癌农杆菌菌液体积为200mL(OD600=0.15),A. alternata分生孢子浓度为106个/mL,在A. tumefaciens的预培养时期以及与A. alternata共培养时期分别加入200μmo1/LAS,共培养时间48h,转化率达120～200个/105分生孢子。在所筛选的约800个转化子中获得了1株毒性明显低于野生菌sd1的弱毒突变株t108,通过PCR验证推测其毒力降低可能由于T-DNA插入阻断了基因的表达。该实验结果为与突变相关基因的研究以及弱毒株t108的进一步研究和利用提供了实验材料,也为深入研究链格孢sd1菌株的基因功能奠定了基础。