产AmpC酶的猪源奇异变形杆菌分离鉴定及生物学特性分析

奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)是一种可导致多种动物感染的条件致病菌,目前有关产AmpC酶的动物源奇异变形杆菌研究较少。为探究广西某猪场母猪流产、死胎的原因,从流产猪胎肝脏中分离到病原菌,对分离株进行纯化培养、染色镜检、生化试验和16S rRNA测序确定为奇异变形杆菌,命名为GX-Y9251株。对GX-Y9251株进行药敏试验、耐药基因检测、AmpC酶基因检测、毒力基因检测、小鼠致病性试验和生物膜半定量检测。药敏试验结果显示,该菌株对8种药物敏感,对17种抗生素耐药。GX-Y9251株存在多种耐药基因,且产AmpC酶,为blaDHA基因。GX-Y9251株存在6个毒力基因,其对小鼠的半数致死量(LD50)为5.4×107CFU;具有生物被膜形成能力,为中等黏附型(++)。研究结果为奇异变形杆菌感染的防治提供了理论依据。

铜绿假单胞菌ampC基因分布和产酶状况对药物敏感性的影响

目的:了解147株铜绿假单胞菌ampC基因分布和产酶状况对药敏的影响。方法:通过聚合酶链反应(PCR)法检测ampC基因分布情况,PCR产物克隆测序;通过酶提取物三维试验检测AmpC酶;纸片扩散法检测铜绿假单胞菌的药敏情况。结果:107株铜绿假单胞菌ampC基因阳性(占72.8%),PCR产物测序结果与Gene-Bank序列(AE 004827)同源性为100%。ampC基因阴性菌株依次对亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟及头孢哌酮/舒巴坦敏感,敏感率均≥90.0%;ampC基因阳性菌株对头孢他啶、头孢吡肟及头孢哌酮/舒巴坦敏感率明显降低(P<0.05);147株铜绿假单胞菌中88株产AmpC酶(占60.0%),不产AmpC酶菌株依次对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟敏感,产AmpC酶菌株仅对亚胺培南、头孢吡肟保持较高敏感率,而对头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南、头孢呋辛敏感率明显降低(P<0.05)。结论:铜绿假单胞菌广泛存在着ampC耐药基因,明确ampC基因分布和产酶状况有助于临床抗菌药物的选用。

儿童感染革兰阴性杆菌中产AmpC酶的基因型分析

目的：研究儿童常见革兰阴性杆菌ampC基因和AmpC酶发生率，分析其产酶与非产酶菌株对抗生素的耐药性。方法：对2002年～2004年我院临床分离的革兰阴性杆菌4022株进行细菌鉴定，K-B法进行药敏试验；选择确认的产超广谱-β内酰胺酶（ESBI。S）菌108株，用聚合酶链反应（PCR）扩增ampC基因；用酶粗提物头孢西丁三维试验检测AmpC酶菌，对产酶株与非产酶株的药敏进行对比分析。结果：108株ESBLs菌中检出70株ampC基因阳性株（占64．8％），7株细菌产AmpC酶（占6．5％）。产AmpC酶菌株对头孢他啶、头孢曲松钠、氧哌嗪青霉素、氨苄青霉素、氨曲南的耐药率分别为85．7％、85．7％、71．4％、79．4％、79．4％；非产AmpC酶菌株对头孢曲松钠、氧哌嗪青霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、氨曲南的耐药率分别为50．8％、55．6％、55．6％、70．3％、54．0％；2种菌株对亚胺培南的耐药率都最低，环丙沙星次之。结论：ampC基因检出率明显高于产AmpC酶，而产AmpC酶菌对常见抗生素的耐药性高于非产AmpC酶菌。

大肠埃希菌高产AmpC酶的研究进展

大肠埃希菌(E.coli)中的ampC基因与其他革兰阴性细菌不同,染色体上的ampC基因启动子与延胡索酸还原酶(frdABCD)操纵子中的frdD基因重叠,衰减子是延胡索酸还原酶操纵子的转录终止子,缺少ampC调节基因ampR,所以携带野生型基因的E.coliAmpC酶的产量非常低,临床意义不大。但近年来出现了高产AmpC酶的E.coli,对其进行研究发现,ampC基因启动子、衰减子或ampC编码区的突变,或从其他细菌获得强启动子或携带强启动子的序列插入,或从其他细菌获得调节基因ampR等都可能导致染色体型AmpC酶的高产。质粒型ampC基因在E.coli中的出现是AmpC酶高产的另一重要原因。

非发酵革兰阴性杆菌产AmpC酶的耐药性及ampC基因分布状况的研究

目的探讨83株非发酵革兰阴性杆菌对11种常用抗生素的耐药性、产AmpC酶的耐药情况及ampC结构基因在非发酵革兰阴性杆菌中的分布状况。方法对临床分离的83株非发酵革兰阴性杆菌(假单胞菌属57株和不动杆菌属26株)用mi croscanwalkaway4.0鉴定到种并鉴定其耐药性,并用酶粗提物头孢西丁三维实验检测AmpC酶,行PCR扩增了解AmpC耐药结构基因在83株非发酵革兰阴性杆菌中的分布情况。结果53株细菌ampC基因阳性(占63.9%),12株细菌产AmpC酶(占14.5%)。83株菌对IPM、CIP、AK、TOB、FEP、CN、CAZ、SXT、PIP、CRO、ATM的药物敏感率从高到低依次为78.3%、74.7%、63.9%、62.7%、60.2%、51.8%、38.6%、32.5%、32.5%、24.1%、22.9%。结论非发酵革兰阴性杆菌的耐药状况严重,明确高产AmpC酶的菌株有助于临床抗菌药物的选用。

临床常见产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampC共同序列的研究

目的分析临床常见AmpC β-内酰胺酶(简称AmpC酶)产酶菌株中染色质ampC的基因序列,从而为AmpC酶的分子生物学检测以及其调控机制研究提供理论依据。方法 57株临床常见AmpC酶产酶菌株分离自医院感染患者样本,抽提细菌染色质DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增ampC基因并连接入pMD19-T载体,双链测序后比对同种细菌之间和不同种细菌之间染色质ampC基因的同源性和共同序列。根据共同序列设计引物,进一步利用该引物检测染色质ampC。结果 57株细菌的基因组中,使用PCR扩增出染色质ampC基因41株,并成功测定了其ampC基因的序列。比对后发现大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌的染色质ampC菌种内有很高的同源性,但细菌之间的同源性较低。根据共同序列设计出菌种特异性PCR引物,能够有效的鉴定出染色质ampC基因。结论大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌各自染色质ampC具有高度同源性,其菌种特异性的ampC引物可用来检测其染色质ampC的存在。

持续高产AmpC酶的检测及其临床意义

目的调查持续高产AmpC酶在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌中的携带率和流行趋势。方法用头孢西丁药敏纸片法(K-B法)和头孢西丁三维试验作AmpC酶的筛选、确证试验,对AmpC酶阳性者进行质粒接合试验。结果11种抗生素中亚胺培南的抗菌活性最强,耐药率仅为1.1%。头孢西丁纸片筛选法阳性率为84.4%,三维试验阳性率为32.2%。与三维试验相比,纸片筛选法总的假阳性率为54.4%,两种方法差异具有高度显著性(P<0.001)。AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、AmpC酶+ESBLs阳性率分别为24.4%、54.4%和7.8%,其中以肺炎克雷伯菌AmpC酶阳性率最高,达33.3%。大肠埃希菌ESBLs阳性率最高,达70.0%。29株AmpC酶阳性菌中,5株耐药质粒转移成功。结论AmpC酶可由染色体或质粒介导,但以染色体介导为主。头孢西丁三维试验可准确检出持续高产AmpC酶,对指导临床用药有积极意义。

产AmpC酶的大肠埃希菌中PBP4的检测及分析

目的检测产AmpCβ-内酰胺酶(简称AmpC酶)的大肠埃希菌中编码非必需青霉素结合蛋白4(PBP4)的基因dacB mRNA表达水平,探讨PBP4在产AmpC酶的革兰阴性菌耐药机制中的作用。方法收集上海市第六人民医院2003至2010年间部分产AmpC酶的大肠埃希菌34株,聚合酶链反应(PCR)扩增dacB基因和ampC基因,实时定量PCR检测dacB mRNA表达水平,并分为dacB mRNA表达上调组与dacB mRNA表达下调组,实时定量PCR方法检测ampC mRNA表达水平。微量肉汤稀释法药敏试验检测抗菌药物的敏感性。结果 34株大肠埃希菌中,26株(76.47%)dacB mRNA表达水平上调,dacB mRNA表达水平上调组ampC mRNA表达水平高于下调组,P<0.05。结论推测大肠埃希菌临床菌株中PBP4高表达有助于产生AmpC酶的高表达,从而引起细菌耐药性的增加。

常见革兰阴性杆菌AmpC酶的检测分析

目的了解常见革兰阴性杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞AmpCs发生率及表型构成,以及产ESBLs的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌AmpC酶的发生率及表型构成。方法采用底物协同-拮抗法(MSSAT)检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌产AmpCs情况及表型构成。结果产ESBLs的大肠埃希菌和产ESBLs的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌AmpC酶检出率分别40%、56%、100%、100%、100%。结论产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌同时存在AmpC酶的机制,应引起临床和实验室工作者的重视。AmpC酶的耐药表型与菌株的耐药程度相关。

产AmpC酶的阴沟肠杆菌检测及其基因分析研究(摘要)

目的了解昆明地区阴沟肠杆菌的耐药现状及高产AmpC酶的表达对阴沟肠杆菌耐药性的影响．探讨昆明地区阴沟肠杆菌的耐药性与AmpC酶基因的关系．方法运用K—B法（纸片扩散）分析临床分离阴沟肠杆菌的耐药情况；采用头孢西丁三维试验、五种纸片表型筛选试验、氟氯西林双抑制剂扩散协同试验检测高产AmpC酶的表型表达；并通过聚合酶链反应（PCR）法检测结构基因ampC和调节基因ampD，对部分耐药菌株行DNA测序检测基因突变．

铜绿假单胞菌产AmpC β-内酰胺酶及外膜孔蛋白OprD_2基因缺失分析

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌中产Amp Cβ-内酰胺酶(简称Amp C酶)及外膜孔蛋白Opr D_2基因缺失的情况。方法采用三维试验检测Amp C酶,聚合酶链反应(PCR)检测外膜孔蛋白Opr D_2基因和Amp C酶结构基因amp C,进行统计学分析。结果 63株铜绿假单胞菌中Amp C酶阳性14株(22.22%);Opr D_2基因阳性22株(Opr D_2基因缺失率65.08%);amp C基因阳性62株(93.94%)。铜绿假单胞菌对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢替坦、头孢曲松和头孢唑啉的耐药率达100.00%。产Amp C酶的菌株对亚胺培南、庆大霉素、头孢吡肟的耐药率分别为42.85%、64.29%和57.14%,不产Amp C酶的菌株分别为30.61%、6.12%和14.29%,二者对庆大霉素和头孢吡肟的耐药率差异均有统计学意义(P<0.01),对亚胺培南的耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。6株Opr D_2缺失合并产Amp C酶的铜绿假单胞菌对亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟的耐药率分别为100.00%、66.67%和55.56%,8株Opr D_2正常表达合并产Amp C酶的菌株分别为0.00%、25.00%和37.50%,二者差异有统计学意义(P<0.05)。结论铜绿假单胞菌多重耐药可能是由多种机制共同控制的,应加强铜绿假单胞菌产酶的监测及耐药基因的分子流行病学研究。

13种抗生素对产AmpC酶或同时产ESBLs细菌的体外抗菌活性

目的 了解临床下呼吸道感染常见革兰氏阴性杆菌产 Amp C酶或同时产超广谱β-内酰胺酶(ESBL s)的情况 ,检测常用 13种抗生素对这些菌株的体外抗菌活性 ,以指导临床合理选择抗生素。方法 采用酶提取物三维试验确证产 Amp C酶或同时产 ESBL s菌株 ,应用琼脂二倍稀释法测定抗生素对这些菌株的最低抑菌浓度 (MICs)。结果 从临床痰标本分离对第一、二代及一种以上第三代头孢菌素耐药的 2 2 6株常见革兰氏阴性杆菌 ,包括阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌 ,其中单产 Amp C酶 34株 ,同时产 Amp C酶和 ESBL s15株 ,总检出率分别为 15 .0 % (34/ 2 2 6 )、6 .6 %(15 / 2 2 6 )。无论单产 Amp C酶还是同时产 Amp C酶和 ESBL s的细菌对第三代头孢菌素、氨曲南及头孢美唑高度耐药 ,敏感率从 0～ 14 .7% ;对含 β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂哌拉西林 /三唑巴坦、阿莫西林 /克拉维酸、头孢哌酮 /舒巴坦耐药情况亦严重 ,敏感率从 0～ 2 9.4 % ;对环丙沙星、左氧氟沙星除大肠埃希氏菌外有较高的敏感性 ,总敏感率均为 71.4 % ;而对亚胺培南高度敏感 ,仅有 1株铜绿假单胞菌耐药。单产 Amp C酶细菌对头孢吡肟、阿米卡星敏感率分别为 97.1%、6 4 .7% ,同时产 Amp C酶?

产超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶肺炎克雷伯菌耐药性及基因型研究

目的 了解我院临床分离的肺炎克雷伯菌耐药性及超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶基因型。 方法采用Microscan微生物鉴定仪、微量肉汤稀释法,测定临床分离的肺炎克雷伯菌对21种抗菌药物的敏感 性;采用聚合酶链反应(PCR)及测序技术分析超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶基因型。结果 肺炎克 雷伯菌对亚胺培南全部敏感,对环丙沙星、哌拉西林／他唑巴坦、头孢他啶、头孢西丁、头孢哌酮／舒巴坦、阿莫西 林／舒巴坦、阿米卡星、头孢噻肟和头孢哌酮的耐药率分别为36.6％、38.3％、56.7％、63.4％、81.7％、86.7％、 96.6％、98.3％和98.3％,对其他药物的耐药率为100％;60株肺炎克雷伯菌全部扩增出TEM基因,有25株细 菌检出CTX-M-Ⅰ群基因,有54株细菌扩增出DHA基因,而PER和MIR(ACT-1)全部为阴性;且有21株肺炎 克雷伯菌同时携带CTX-M-Ⅰ群、DHA和TEM基因。结论我院临床分离的肺炎克雷伯菌为多重耐药菌,同时 存在CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶和DHA-1型质粒介导的AmpC酶,尚未发现PER型超广谱β-内酰胺酶和 MIR型质粒介导的AmpC酶。

阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶基因的研究

目的调查阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶基因的流行状况及基因型。方法采用ATB药敏试验板微量肉汤法,对44株临床分离的阴沟肠杆菌进行抗菌药物敏感试验,PCR方法检测DHA和ACT型AmpC酶基因。结果44株阴沟肠杆菌呈多重耐药;36株质粒AmpC酶基因阳性(81.8%),DHA和ACT-1基因阳性率分别为11.4%、79.5%,而且3株阴沟肠杆菌同时携带DHA和ACT-1基因。结论临床分离的阴沟肠杆菌多重耐药严重、质粒AmpC酶基因携带率高;阴沟肠杆菌中检出ACT-1基因为国内首次报道。

阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检测

目的：去阻遏持续高产ＡｍｐＣ酶，或产生超广谱β－内酰胺酶（ＥＳＢＬｓ），或同时高表达这两类酶，是阴沟肠杆菌对多种β－内酰胺类抗生素耐药的主要机制。方法：建立了一种改良的酶提取物三维试验法，在常规ＮＣＣＬＳ纸片扩散法基础上接种大肠杆菌ＡＴＣＣ ２５９２２，在头孢西叮药敏纸片周围放射性切出琼脂小槽，待测菌的粗酶提取物在槽内扩散，与头孢西叮纸片扩散相交。结果：由于ＡｍｐＣ酶水解头孢西叮，出现抑菌圈内生长细菌，这一现象能被加入槽内的邻氯西林抑制，而ＥＳＢＬｓ不能水解头孢西叮，无此现象。因邻氯西林不能抑制ＥＳＢＬｓ活性，同样用头孢由松取代头抱西叮纸片，用邻氯西林抑制槽内ＡｍｐＣ酶，可测出 ＥＳＢＬｓ。使用该法检测分别产 ＡｍｐＣ酶、 ＥＳＢＬｓ的标准株和 ２４株临床分离多重耐药的阴沟肠杆菌。结果各种标准株检测无误，２４株阴沟肠杆菌中，１４株去阻遏持续高产ＡｍｐＣ酶试验阳性，４株产ＥＳＢＬｓ试验阳性，５株此两类酶检测均阳性，１株此两类酶检测均阴性，原因待分析。结论：对于阴沟肠杆菌，这种改良的酶提取物三维试验法能较好地鉴别持续高产 ＡｍｐＣ酶和 ＥＳＢＬ的阴沟肠杆菌，并适用于临床常规检验。

肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶基因检测及耐药性分析

目的了解下呼吸道感染肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和质粒AmpC酶的产生情况及耐药性,研究AmpC酶的基因型别。方法用纸片扩散确证法检测ESBLs;用酶提取三维试验检测AmpC酶,聚合酶链反应(PCR)扩增AmpC酶的基因,DNA序列测定检测AmpC酶的基因型;K-B法检测细菌耐药性。结果58株下呼吸道感染肺炎克雷伯菌中ESBLs阳性21株,AmpC酶阳性5株,其中3株ESBLs和AmpC酶均阳性,5株AmpC酶阳性菌中,4株扩增出DHA基因,经测序均为DHA-1,1株扩增出MIR基因。产酶菌株的耐药性明显高于非产酶株。结论肺炎克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶均有较高的检出率,AmpC酶以DHA基因型为主。产ESBLs和AmpC酶是肺炎克雷伯菌耐药的主要原因。

ESBLs阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产AmpC酶的检测与体外抗菌活性分析

目的检测杭州市4所医院分离的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的AmpC酶,并对临床常用的抗菌药物进行体外抗菌活性分析。方法收集2005-2006年浙江省人民医院、浙江大学医学院附属第二医院、杭州市中医院、浙江大学医学院附属第一医院的ESBLs阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共324株,用纸片法和三维试验检测AmpC酶,并用多重PCR分析AmpC酶的基因型,对产AmpC酶的病原菌采用琼脂稀释法测定临床常用的10种抗菌药物的最低抑菌浓度(MICs)。结果324株ESBLs阳性菌株用表型筛选试验筛选出76株产AmpC酶菌株,阳性率为23.5%,用多重PCR共扩增到53株AmpC酶基因型,检出率为69.7%,碳青酶烯类抗菌药物MIC50<0.25μg/ml,同时还发现4株耐碳青酶烯酶菌株。结论在杭州市ESBLs阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中存在较高的AmpC酶发生率,碳青酶烯类抗菌药物具有较好的抗菌活性。

肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶基因的研究

目的研究肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌中ESBLs和AmpCβ-内酰胺酶的存在形式及其基因类型和转移方式。方法利用CLSI纸片法确认实验和APB纸片增强试验分别检测ESBLs和AmpC酶,基因芯片技术和序列分析测定两种酶基因的类型,接合转移实验了解肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌耐药基因转移方式。结果在对头孢西丁不敏感的72株肺炎克雷伯菌和20株产酸克雷伯菌中,以同时产生ESBLs和AmpC酶为主要形式,分别占54.2%和75.0%;单产ESBLs分别为22.2%和25.0%,肺炎克雷伯菌中单产AmpC酶占12.5%;肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌中的AmpC酶基因绝大多数为DHA型(测得DHA-1型基因),ESBLs则以SHV型为主(测得SHV-12型),它们均能通过接合转移方式将其质粒携带的耐药性传递至受体菌。结论同时存在的ESBLs和AmpC酶是肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌耐药的主要原因,耐药基因的转移可导致耐药性的传播扩散。