产AmpC酶的猪源奇异变形杆菌分离鉴定及生物学特性分析

奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)是一种可导致多种动物感染的条件致病菌,目前有关产AmpC酶的动物源奇异变形杆菌研究较少。为探究广西某猪场母猪流产、死胎的原因,从流产猪胎肝脏中分离到病原菌,对分离株进行纯化培养、染色镜检、生化试验和16S rRNA测序确定为奇异变形杆菌,命名为GX-Y9251株。对GX-Y9251株进行药敏试验、耐药基因检测、AmpC酶基因检测、毒力基因检测、小鼠致病性试验和生物膜半定量检测。药敏试验结果显示,该菌株对8种药物敏感,对17种抗生素耐药。GX-Y9251株存在多种耐药基因,且产AmpC酶,为blaDHA基因。GX-Y9251株存在6个毒力基因,其对小鼠的半数致死量(LD50)为5.4×107CFU;具有生物被膜形成能力,为中等黏附型(++)。研究结果为奇异变形杆菌感染的防治提供了理论依据。

一株多重耐药大肠杆菌全基因组测序及其耐药性分析

为了解大肠杆菌携带的粘菌素耐药基因并筛选敏感药物,解决多重耐药和动物临床无药可选的困局,采用16S rRNA菌种全基因组测序,PCR筛查mcr-4、mcr-5、blaTEM和AmpC酶耐药基因,应用BLAST和MEGA软件进行生物信息学和系统进化树分析,并对该菌株进行了78种抗生素抗菌药物敏感性测试及4种天然植物提取物(黄藤素、黄连素、黄芩苷和博落回)的抑菌、杀菌效果试验。结果表明,从2021年(1—12月)和2022年(1—6月)猪临床腹泻病例肠道中分离鉴定的145株大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中,鉴定出1株同时携带粘菌素耐药基因(mcr-4,mcr-5)和β内酰胺酶blaTEM、AmpC基因的猪源大肠埃希氏菌临床菌株HN2149。78种抗生素药敏试验结果显示,HN2149菌株对头孢吡肟、头孢地嗪、磷霉素、头孢克肟、头孢唑林、头孢哌酮、美洛培南、头孢西丁、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢噻肟/克拉维酸、头孢唑肟、头孢美唑、头孢他啶/克拉维酸和头孢他美敏感,对其余57种抗菌药物表现为耐药。4种植物提取物的药敏结果显示,博落回对菌株HN2149的抑菌、杀菌效果较好,其余3种提取物均对该菌株无抑菌和杀菌效果。以上研究结果为猪大肠杆菌病的防控提供参考。

产超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶肺炎克雷伯菌耐药性及基因型研究

目的 了解我院临床分离的肺炎克雷伯菌耐药性及超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶基因型。 方法采用Microscan微生物鉴定仪、微量肉汤稀释法,测定临床分离的肺炎克雷伯菌对21种抗菌药物的敏感 性;采用聚合酶链反应(PCR)及测序技术分析超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶基因型。结果 肺炎克 雷伯菌对亚胺培南全部敏感,对环丙沙星、哌拉西林／他唑巴坦、头孢他啶、头孢西丁、头孢哌酮／舒巴坦、阿莫西 林／舒巴坦、阿米卡星、头孢噻肟和头孢哌酮的耐药率分别为36.6％、38.3％、56.7％、63.4％、81.7％、86.7％、 96.6％、98.3％和98.3％,对其他药物的耐药率为100％;60株肺炎克雷伯菌全部扩增出TEM基因,有25株细 菌检出CTX-M-Ⅰ群基因,有54株细菌扩增出DHA基因,而PER和MIR(ACT-1)全部为阴性;且有21株肺炎 克雷伯菌同时携带CTX-M-Ⅰ群、DHA和TEM基因。结论我院临床分离的肺炎克雷伯菌为多重耐药菌,同时 存在CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶和DHA-1型质粒介导的AmpC酶,尚未发现PER型超广谱β-内酰胺酶和 MIR型质粒介导的AmpC酶。

阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶基因的研究

目的调查阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶基因的流行状况及基因型。方法采用ATB药敏试验板微量肉汤法,对44株临床分离的阴沟肠杆菌进行抗菌药物敏感试验,PCR方法检测DHA和ACT型AmpC酶基因。结果44株阴沟肠杆菌呈多重耐药;36株质粒AmpC酶基因阳性(81.8%),DHA和ACT-1基因阳性率分别为11.4%、79.5%,而且3株阴沟肠杆菌同时携带DHA和ACT-1基因。结论临床分离的阴沟肠杆菌多重耐药严重、质粒AmpC酶基因携带率高;阴沟肠杆菌中检出ACT-1基因为国内首次报道。

13种抗生素对产AmpC酶或同时产ESBLs细菌的体外抗菌活性

目的 了解临床下呼吸道感染常见革兰氏阴性杆菌产 Amp C酶或同时产超广谱β-内酰胺酶(ESBL s)的情况 ,检测常用 13种抗生素对这些菌株的体外抗菌活性 ,以指导临床合理选择抗生素。方法 采用酶提取物三维试验确证产 Amp C酶或同时产 ESBL s菌株 ,应用琼脂二倍稀释法测定抗生素对这些菌株的最低抑菌浓度 (MICs)。结果 从临床痰标本分离对第一、二代及一种以上第三代头孢菌素耐药的 2 2 6株常见革兰氏阴性杆菌 ,包括阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌 ,其中单产 Amp C酶 34株 ,同时产 Amp C酶和 ESBL s15株 ,总检出率分别为 15 .0 % (34/ 2 2 6 )、6 .6 %(15 / 2 2 6 )。无论单产 Amp C酶还是同时产 Amp C酶和 ESBL s的细菌对第三代头孢菌素、氨曲南及头孢美唑高度耐药 ,敏感率从 0～ 14 .7% ;对含 β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂哌拉西林 /三唑巴坦、阿莫西林 /克拉维酸、头孢哌酮 /舒巴坦耐药情况亦严重 ,敏感率从 0～ 2 9.4 % ;对环丙沙星、左氧氟沙星除大肠埃希氏菌外有较高的敏感性 ,总敏感率均为 71.4 % ;而对亚胺培南高度敏感 ,仅有 1株铜绿假单胞菌耐药。单产 Amp C酶细菌对头孢吡肟、阿米卡星敏感率分别为 97.1%、6 4 .7% ,同时产 Amp C酶?

阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检测

目的：去阻遏持续高产ＡｍｐＣ酶，或产生超广谱β－内酰胺酶（ＥＳＢＬｓ），或同时高表达这两类酶，是阴沟肠杆菌对多种β－内酰胺类抗生素耐药的主要机制。方法：建立了一种改良的酶提取物三维试验法，在常规ＮＣＣＬＳ纸片扩散法基础上接种大肠杆菌ＡＴＣＣ ２５９２２，在头孢西叮药敏纸片周围放射性切出琼脂小槽，待测菌的粗酶提取物在槽内扩散，与头孢西叮纸片扩散相交。结果：由于ＡｍｐＣ酶水解头孢西叮，出现抑菌圈内生长细菌，这一现象能被加入槽内的邻氯西林抑制，而ＥＳＢＬｓ不能水解头孢西叮，无此现象。因邻氯西林不能抑制ＥＳＢＬｓ活性，同样用头孢由松取代头抱西叮纸片，用邻氯西林抑制槽内ＡｍｐＣ酶，可测出 ＥＳＢＬｓ。使用该法检测分别产 ＡｍｐＣ酶、 ＥＳＢＬｓ的标准株和 ２４株临床分离多重耐药的阴沟肠杆菌。结果各种标准株检测无误，２４株阴沟肠杆菌中，１４株去阻遏持续高产ＡｍｐＣ酶试验阳性，４株产ＥＳＢＬｓ试验阳性，５株此两类酶检测均阳性，１株此两类酶检测均阴性，原因待分析。结论：对于阴沟肠杆菌，这种改良的酶提取物三维试验法能较好地鉴别持续高产 ＡｍｐＣ酶和 ＥＳＢＬ的阴沟肠杆菌，并适用于临床常规检验。

阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶的耐药调查

目的 了解阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶 ,或产超广谱β 内酰胺酶 (ESBLs)及同时表达这两类酶的现状及耐药性 ,指导医生临床用药。方法 采用改良的酶提取物三维试验法 ,检测阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶 ,用表型确证试验检测ESBLs,并用K B法对抗菌药物进行体外药敏试验。结果 在 6 8株阴沟肠杆菌中 ,8株持续高产AmpC酶 ,14株产ESBLs,3株同时表达这两种酶。结论 产酶菌株对抗菌药物的耐药性远远高于不产酶菌 ,且多重耐药 ,改良的酶提取物三维试验法 ,能较好地检测阴沟肠杆菌持续高产AmpC酶 ,适用于临床常规检验 ,为临床医生使用抗菌药物提供合理建议 。

大肠埃希菌、克雷伯菌中质粒AmpC酶的流行分布

目的了解我院大肠埃希菌、克雷伯菌中质粒AmpC酶的流行分布及其基因型特征。方法对1 935株大肠埃希菌、克雷伯菌进行了AmpC酶纸片扩散法筛选试验(头孢西丁≤18),对筛选阳性株分别进行三维试验、多重聚合酶链反应(PCR)、等电聚焦电泳(IEF)、接合试验、PCR及测序,以确定表型及基因型。结果1 935株细菌中,纸片筛选、三维试验、多重PCR的阳性数分别为327、85、54株;13株产C IT群质粒AmpC酶细菌有4株接合试验阳性;IEF证实这4株细菌均产生等电点为9.0、可以被氯唑西林抑制而不能被克拉维酸抑制的β-内酰胺酶。结论我院大肠埃希菌、克雷伯菌中质粒AmpC酶的阳性率为2.79%(54/1 935)。基因型为DHA群和C IT群2类。

检测AmpC酶三维试验方法的改进

目的简便检测AmpC酶三维试验的方法。方法将提取AmpC酶冻溶的温度-70℃改为-20℃,将加酶的挖槽法改为打孔法。结果55株耐三代头孢菌素和头孢西丁的细菌,用两种冻溶方法均检出6株高产AmpC酶菌,其中用原提酶法,5株菌在挖槽和打孔中加入粗酶液10μl,另1株菌在挖槽和打孔中加入粗酶液30μl时出现阳性结果;用改进提酶法,5株菌在挖槽和打孔中加入粗酶液10μl,另1株菌在打孔中加入粗酶液30μl,而在挖槽中加入50μl时出现阳性结果。结论改进的提取AmpC酶的方法与原方法结果相同,改进的加酶打孔法比挖槽法优越,改进的三维试验方法简便、准确、不需要特殊设备,适合于各级实验室应用。

铜绿假单胞菌ampC基因分布和产酶状况对药物敏感性的影响

目的:了解147株铜绿假单胞菌ampC基因分布和产酶状况对药敏的影响。方法:通过聚合酶链反应(PCR)法检测ampC基因分布情况,PCR产物克隆测序;通过酶提取物三维试验检测AmpC酶;纸片扩散法检测铜绿假单胞菌的药敏情况。结果:107株铜绿假单胞菌ampC基因阳性(占72.8%),PCR产物测序结果与Gene-Bank序列(AE 004827)同源性为100%。ampC基因阴性菌株依次对亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟及头孢哌酮/舒巴坦敏感,敏感率均≥90.0%;ampC基因阳性菌株对头孢他啶、头孢吡肟及头孢哌酮/舒巴坦敏感率明显降低(P<0.05);147株铜绿假单胞菌中88株产AmpC酶(占60.0%),不产AmpC酶菌株依次对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟敏感,产AmpC酶菌株仅对亚胺培南、头孢吡肟保持较高敏感率,而对头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南、头孢呋辛敏感率明显降低(P<0.05)。结论:铜绿假单胞菌广泛存在着ampC耐药基因,明确ampC基因分布和产酶状况有助于临床抗菌药物的选用。

耐头孢西丁革兰阴性杆菌高产AmpC酶发生率及基因型与耐药性研究

目的了解耐头孢西丁革兰阴性杆菌高产AmpC酶发生率及基因型分布和耐药性。方法对155株无重复耐头孢西丁革兰阴性杆菌,用酶提取物三维试验检测AmpC酶;ATB药敏试验板和K-B法检测产酶株的药物敏感性;质粒转化试验定位耐药基因;PCR扩增AmpC酶与ESBLs基因及其序列测定确定其基因型。结果高产AmpC酶的发生率为23.2%;自2株肺炎克雷伯菌和5株大肠埃希菌中检出DHA-1、CMY-2和CMY-22型AmpC酶,5株大肠埃希菌还分别同时携带TEM-1型广谱酶和TEM-144、CTX-M-27和CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶;CMY-22型和TEM-144型β-内酰胺酶是国内外首次报道,获得美国GenBank登录号分别为DQ256079和DQ256080。结论加强耐头孢西丁革兰阴性杆菌高产AmpC酶的监测,治疗相关菌感染以亚胺培南和美罗培南为首选;福州发现DHA-1、CMY-2和CMY-22型AmpC酶。

ESBLs阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产AmpC酶的检测与体外抗菌活性分析

目的检测杭州市4所医院分离的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的AmpC酶,并对临床常用的抗菌药物进行体外抗菌活性分析。方法收集2005-2006年浙江省人民医院、浙江大学医学院附属第二医院、杭州市中医院、浙江大学医学院附属第一医院的ESBLs阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共324株,用纸片法和三维试验检测AmpC酶,并用多重PCR分析AmpC酶的基因型,对产AmpC酶的病原菌采用琼脂稀释法测定临床常用的10种抗菌药物的最低抑菌浓度(MICs)。结果324株ESBLs阳性菌株用表型筛选试验筛选出76株产AmpC酶菌株,阳性率为23.5%,用多重PCR共扩增到53株AmpC酶基因型,检出率为69.7%,碳青酶烯类抗菌药物MIC50<0.25μg/ml,同时还发现4株耐碳青酶烯酶菌株。结论在杭州市ESBLs阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中存在较高的AmpC酶发生率,碳青酶烯类抗菌药物具有较好的抗菌活性。

产生ESBLs和AmpC酶的肠杆菌科细菌检测及耐药性分析

目的了解我院产ESBLs和AmpC酶细菌的耐药性。方法对产ESBLs菌和产生AmpC酶菌进行表型的筛选和确证,测定21种药物的耐药性。结果 268株菌中检出ESBLs菌136株,检出率50.75%,AmpC酶菌116株,检出率43.28%。单产AmpC酶菌,单产ESBLs菌及产AmpC和ESBLs的菌对青霉素、第二、三代头孢菌素类药物的耐药率明显高于非产酶菌的耐药率,两者相比有显著性差异(P<0.05),多重耐药及泛耐药常见。结论 ESBLs与Amp酶已成为我院肠杆菌科细菌耐药的主要原因。碳青霉烯类、第四代头孢菌素、哌拉西林/三唑巴坦成为我院治疗院内感染的首选药。

多重PCR技术检测肺炎克雷伯菌中质粒介导的AmpC酶基因

目的建立多重PCR技术检测肺炎克雷伯菌(K.pneu)中质粒型ampC基因。方法收集临床分离的表型可疑为产AmpC酶的24株K.pneu,用ampC基因的5群6个亚型的引物进行多重聚合酶链反应(mu l-PCR),用三维酶抑制试验检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶,结合mu l-PCR、三维酶抑制试验和表型试验进行基因和表型分析。同时选择4株菌(3株ampC基因阳性,1株阴性)进行转质粒试验,以证实质粒型基因的存在。结果在mu l-PCR试验中,有22株扩增出C-4族中长度405 bp的片段,1株扩增出C-1族中长度462 bp的片段;1株未扩增出目的条带。三维酶抑制试验中,24株菌中有19株菌未检出AmpC酶,但药物敏感试验中有诱导耐药现象,符合C-4(DHA)族基因诱导表达的特性。转质粒试验中,3株ampC基因阳性的供体菌均将其ampC基因转入受体菌。结论采用多重PCR技术可以简化质粒型ampC基因的检测方法。在我院临床分离的K.pneu中,出现质粒编码的AmpC酶,以C-4族基因为主要流行型。

铜绿假单胞菌质粒型AmpC酶DHA基因的发现

目的测定35株同时耐头孢他啶、头孢噻肟、头孢西丁、氨曲南铜绿假单胞菌质粒型AmpC酶DHA。 方法 用PCR法对铜绿假单胞菌质粒型AmpC酶DHA基因进行检测,并对阳性产物作PCR产物直接DNA测 序。结果35株铜绿假单胞菌DHA基因扩增结果2株呈阳性,其中1株测得序列为DHA-Ⅰ型。结论表明我 国同时耐头孢他啶、头孢噻肟、头孢西丁、氨曲南铜绿假单胞菌也已获得DHA基因,AmpC酶DHA基因可通过 转化、接合等方式转移给其他同种或不同种菌且易于传播,因此加强监控以防DHA基因在国内某些地区的革兰 阴性菌中流行。

高产AmpC酶肺炎克雷伯菌的临床报道

的 对临床分离出的高产AmpC肺炎克雷伯菌分子生物学以及耐药特性进行研究。方法 对从临床分离的 1株头孢西丁高度耐药的肺炎克雷伯菌进行分析 ;用三维试验初步检测其高产AmpC ,然后用等电聚焦以及酶抑制试验等进行确认 ;用接合试验检验耐药基因的转移性 ,最后用E TEST法进行最小抑菌浓度 (MIC)测定。结果 该菌株三维试验为阳性 ,等电聚焦以及酶抑制试验表明 ,该菌株产一种等电点 (PI)为 7 8的能够被氯唑西林抑制而不能被克拉维酸抑制的 β 内酰胺酶 ;接合试验表明表达该 β 内酰胺酶的基因具有转移性 ,用E TEST法检测表明该菌株对环丙沙星、阿米卡星、青霉素类、酶抑制剂合剂及三代头孢菌素类均耐药 ,但它们对头孢吡肟、碳青酶烯类的亚胺培南和伊他培南均敏感。结论 我院临床分离肺炎克雷伯菌已经出现中高产AmpC菌株 ,其耐药性能够水平传播 ,并造成对多种三代头孢菌素及头孢西丁耐药 ,已经对临床的抗生素治疗带来重大威胁。

鸡源大肠杆菌分离鉴定及ESBLs与AmpC酶基因型检测及耐药性分析

为了解山西省范围内鸡源产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC)大肠杆菌分离株的基因型及其耐药现状,本试验从呈现典型鸡大肠杆菌病临床症状的病料中分离、鉴定出68株符合鸡源大肠杆菌生物特性的流行菌株,采用K-B法与双纸片确认法对分离的68株大肠杆菌分别进行药敏试验和ESBLs、AmpC酶耐药表型的筛选;采用PCR方法检测了分离株中质粒介导的ESBLs、AmpC酶的基因型。结果显示,分离到的68株菌对22种抗菌药物均产生不同程度的耐药性,其中耐药谱达7耐以上的有66,占总分离菌株数的97.06%;呈ESBLs、AmpC酶阳性和两者均阳性的菌株数分别为57(83.82%)、19(27.94%)和16(23.53%)株;检测出ESBLs阳性菌株携带的耐药基因型包括bla TEM、bla OXA和bla CTX-M-1/9,AmpC酶阳性菌株耐药基因型为bla FOX型。研究结果表明,分离的68株鸡源大肠杆菌已对绝大多数种类抗菌药物产生耐药性,且产ESBLs和AmpC酶菌株已普遍流行。山西省鸡源大肠杆菌中流行的ESBLs基因型与国内其他地区相关报道大体一致,而检测到的bla FOX型AmpC酶基因在国内报道相对较少。

大肠埃希菌中AmpC酶和质粒介导的ampC基因的发生和检测

目的从临床分离的大肠埃希菌(E.coli)中检测AmpC酶及质粒介导的ampC基因。方法选择从临床分离的可疑产ESBLs和AmpC 2种酶的40株大肠埃希菌,用NCCLS推荐的微量肉汤稀释法检测耐药表型,三维酶试验检测AmpC酶和ES-BLs,PCR扩增质粒型ampC基因和ESBLs基因,肉汤交配法检测质粒型ampC基因的接合传递性。结果在三维试验中,40株菌中有39株产β-内酰胺酶,其中21株产ESBLs和AmpC 2种酶,15株单产ESBLs,3株单产AmpC酶。在PCR扩增试验中,8株扩增出质粒介导的ampC基因,7株为C IT型,1株为DHA型;34株扩增出b laTEM、b laCTX-M、b laOXA 3型ESBLs基因中的至少1个型,未扩增出b laSHV。8株携带质粒型ampC基因的菌株,共筛选出9株接合子。结论AmpC酶已在我院的大肠埃希菌中出现,由质粒编码的AmpC酶可在细菌间传递。

铜绿假单胞菌AmpC酶基因、调控基因及氨基酸序列研究

目的 测定不同耐药谱铜绿假单胞菌AmpC酶ampC基因、调控基因及氨基酸序列。方法 筛选铜绿假单胞菌株 6株 ,获取AmpC酶及鉴定 ,菌落PCR扩增目的基因片段 ,鉴定产物 ,测序。结果 测出了铜绿假单胞菌AmpC酶部分ampC基因、调控基因ampR、ampD及部分ampE的核苷酸序列。结论 所观察耐药菌株的ampC基因和调控基因ampR、ampD及ampE与标准菌株染色体介导的AmpC酶基因及氨基酸序列具有同源性 ;发现一些新突变位点。

鲍曼不动杆菌ADC型AmpC β-内酰胺酶基因研究

目的了解浙江湖州解放军第98医院自临床分离的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中ADC型AmpC β-内酰胺酶基因（blaADC）存在状况。方法收集2000年7月-2002年12月所分离到的60株鲍曼不动杆菌，采用聚合酶链反应及序列分析的方法分析blaADC基因。结果60株中有59株blaADC基因呈阳性（98．3％），序列分析表明4号菌株（原始编号HZB3944）blaADC基因为-新亚型，其核酸序列已登录GenBank（注册号EF569589）。结论鲍曼不动杆菌中blaADC基因阳性率很高，产ADC型AmpC β-内酰胺酶是本组菌株对β-内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。