福寿螺(Ampullaria crossean)mfc基因的分子克隆和序列分析

目的:从福寿螺胃组织细胞中克隆多功能纤维素酶基因(mfc)。方法:设计引物,采用RT-PCR方法从福寿螺胃组织细胞中扩增多功能纤维素酶基因,与pGEMT-easy载体连接,转化大肠杆菌DH5α。结果:该基因全长为1225bp,上游5′端非翻译区19bp,3′端非编码区21bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)1185bp,编码395个氨基酸,推测等电点pI为6.57,分子质量45.8kDa。推测的多功能纤维素酶具有糖苷水解酶保守的氨基酸序列,属于糖苷水解酶第10家族。同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与egx(Gen-Bank Accession No.AAP31839)的同源性分别为99.3%和99.8%,在8个位点出现核苷酸差异,在1个位点出现氨基酸差异。通过软件分析并预测,该基因编码的蛋白共存在14个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点,没有信号肽序列。结论:成功克隆出福寿螺多功能纤维素酶基因。

福寿螺糖苷水解酶基因核心片断的克隆及序列分析

从福寿螺的胃部组织中获得总RNA,经RT-PCR扩增、测序得到1条新糖苷水解酶基因片段。分析显示其ORF(Open Reading Frame)全长882 bp,编码294个氨基酸。与福寿螺多功能纤维素酶EGX的C端高度同源性达到89.8%,含有糖苷水解酶第10家族的保守性氨基酸序列。

福寿螺多功能纤维素酶基因egx的克隆及其体外功能性表达

【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx,并在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达分析。【方法】通过RT-PCR的方法,从福寿螺胃组织总RNA中克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx序列,连接克隆载体pMD18-T,再通过Eco RⅠ和NotⅠ两个酶切位点分别与表达载体pET-32a(+)及pcDNA3.1(+)连接,构建原核、真核表达载体,并在E.coli BL-21(DE3)和猪肾细胞PK15中进行表达,最后采用DNS法测定表达产物酶学活性。【结果】RT-PCR扩增得到1 326 bp的序列,包括1 185 bp的编码序列和部分侧翼序列,编码序列与已报道的福寿螺多功能纤维素酶基因cDNA序列相似性为99%,氨基酸序列相似性为100%。原核细胞表达产物经包涵体复性后,对羧甲基纤维素钠、2-羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、微晶纤维素、木聚糖的水解活性分别为:24.78、15.67、18.42、600.91和175.43 U.mg-1;而在PK15细胞中重组酶对以上5种底物的活性分别为:0.84、0.78、1.01、14.62和4.23 U.mL-1。【结论】克隆出了福寿螺多功能纤维素酶基因,并能在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功地表达。

基于毛木耳CDS的福寿螺多功能纤维素酶基因密码子优化分析

【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因(multi-functional cellulase gene,Mfc),进行密码子优化改造,便于后续毛木耳Mfc基因转导研究。【方法】采用Codon W软件分析福寿螺多功能纤维素酶基因Mfc及毛木耳转录本CDS密码子使用次数和同义密码子相对使用度差异,以毛木耳CDS密码子特征对福寿螺Mfc基因进行密码子优化。【结果】改造后的Mfcsg序列GC含量从原始Mfc序列的54.04%增加到58.16%,与毛木耳遗传背景一致。【结论】实验优化后获得的Mfcsg基因序列GC含量与毛木耳遗传背景一致,没有发夹结构、重复序列及反向重复序列,能够作为毛木耳外源基因转化应用。

福寿螺多功能纤维素酶EGXA在酿酒酵母中的表达

研究在酿酒酵母中表达福寿螺内源性纤维素酶基因egxa cDNA。结果显示:重组酶水解对-硝基酚纤维二糖苷(pNPC)、微晶纤维素(sigmacell)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)以及Oat spelt的木聚糖(xylan from oatspelt,麦木聚糖)等4种底物的活力分别为1.25,84,70和196U/L,并发现了天然信号肽,酵母性因子信号肽(MFα1)对重组酶表达的影响。