鱼腥藻PCC 7120乙酰辅酶A合成酶All0769的缺失降低异形胞频率

研究鉴定了All0769为鱼腥藻PCC 7120中乙酰辅酶A合成酶,通过CRISPR/Cpf1系统敲除鱼腥藻PCC 7120中的乙酰辅酶A合成酶(由all0769编码),探究了乙酰辅酶A合成酶在异形胞分化中的调控机制。结果所示:All0769能在体外反应中催化乙酰辅酶A的生成。在供氮环境下,敲除all0769会影响藻细胞生长速率。而无论环境中是否存在化合氮,Δall0769突变株的乙酰辅酶A和α-酮戊二酸含量均显著减少。在供氮环境下,Δall0769突变株中检测到(26.17±1.55)nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(43.04±1.09)nmol/mg的乙酰辅酶A。Δall0769突变株的α-酮戊二酸[(1.41±0.24)nmol/mg protein]低于野生型的α-酮戊二酸[(2.13±0.05)nmol/mg protein]。在缺氮环境下,Δall0769突变株中检测到(10.00±2.81)nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(29.82±4.04)nmol/mg protein的乙酰辅酶A。Δall0769突变株的α-酮戊二酸含量[(1.48±0.35)nmol/mg protein]低于野生型的α-酮戊二酸[(2.74±0.33)nmol/mg protein]。此外,Δall0769突变株异形胞分化频率(7.12%)显著低于野生型异形胞分化频率(9.22%)。综上所述:文章鉴定了All0769是鱼腥藻PCC 7120中的乙酰辅酶A合成酶。在鱼腥藻PCC 7120中,缺失乙酰辅酶A合成酶(All0769)会减少乙酰辅酶A的含量,进而下调α-酮戊二酸含量使异形胞频率降低。

蓝藻Anabaena sp.PCC7120羧体碳酸酐酶的鉴定

在丝状蓝藻AnabaenaspPCC7120细胞租提液的碳酸酥酶（CA）分析中，发现了两种形式的CA活性．高CO2下生长的细胞，在35pmol／LEZ（Ethoxyzoamide，碳酸醉酶的抑制剂）存在的情况下，CA总活性的85％左右被抑制，其半抑制浓度I50为7.4μmol／L；随着EZ浓度的继续增加，CA活性在EZ浓度达到约150μmol／L处出现了第二个抑制峰，在250μmol／L处抑制程度达到最大，使CA总活性的15％被抑制，其半抑制浓度I50为190μmol／L．在空气条件下生长的细胞中也出现了CA的两个抑制峰：低I50为6μmol／L，高I50为120μmol／L．对核体的分离及体外测试表明，在波体制备物中的CA活性只有一个EZ的抑制峰，而且在EZ浓度达到35μmol／L，正如所期望的那样，该CA活性全部被抑制．其半抑制浓度150为5．2μmol／L左右．这个值跟空气或高CO2条件下生长的细胞粗提物中的低I50（6μmol／L或7．4μmol／L）十分相似．说明低浓度的EZ可以特异性地抑制定位于校体的CA活性．另外一种形式的CA，具有高I50（120－190μmol／L），约占CA总活性的15－20％，则有可能定位于细胞质膜．

光催化纳米TiO_2治理蓝藻工艺的研究

在波长253.7 nm紫外线C波段(UV-C)照射下,对受试蓝藻进行光催化纳米TiO2氧化反应,探讨反应参数对实验工艺处理效果的影响。对蓝藻生理指标叶绿素a(Chl-a)含量测定显示:在辐照光强0.15 mW/cm2、纳米TiO2浓度100 mg/L下反应,其Chl-a含量下降速率最快;随着辐照剂量、通入空气量(Qair)和反应温度的增大,其Chl-a含量下降速度不断加快;加入1.0 mmol/L H2O2加快了Chl-a含量下降,而加入20 mmol/L抗坏血酸(Vc)则减缓Chl-a含量下降;在偏碱性或低于纳米TiO2零电点(6.25)时,有利于加快Chl-a含量下降。结果表明,光催化纳米TiO2氧化反应能够有效降低受试蓝藻Chl-a含量,在以上参数适宜反应条件下,可以更好提高光催化纳米TiO2治理蓝藻工艺的处理效果。

鱼腥藻PCC7120细胞液泡的初步研究

从保存３个月以上的老化培养物中直接检查到游离液泡。液泡为标准圆球状，完全透明，大小相差极为悬殊，多数大型液泡吞噬了数个衰老藻细胞。采用低渗酶解，渗透冲击，低渗酶解和渗透冲击相结合，从培养３个月以上，２个月，１个月，１８ｄ，１０ｄ及３ｄ的藻丝细胞都分离到液泡。液泡略大于细胞，泡内无吞噬物。培养３ｄ的藻丝有１５％的细胞分离到液泡。其他多种蓝藻也分离到同样的液泡。

外源Ca^(2+)对模拟微重力环境中鱼腥藻细胞质膜透性和光合特性的影响

以鱼腥藻为材料 ,研究了外源Ca2 +对模拟微重力环境中微藻细胞膜透性的影响。实验结果表明 :提高培养基中的Ca2 +浓度可减轻由模拟微重力造成的膜透性增大 ,有助于稳定细胞膜结构和功能。同时 ,外源Ca2 +降低了藻细胞光系统Ⅱ (PSⅡ )的光化学效率 (以荧光参数Fv/Fm表示 )下降的幅度 ,表明外源Ca2 +对模拟微重力环境下鱼腥藻细胞光合作用的损伤 ,有良好的防护效应。

氮磷质量浓度对普通小球藻和鱼腥藻生长竞争的影响

研究氮磷质量浓度对藻类生长竞争的影响,对于揭示如何通过控制环境因子促进有益藻类生长繁殖、抑制有害藻类生长繁殖,并利用藻类调节养殖环境和提高水体初级生产力具有重要意义。设置了4个氮磷质量浓度梯度(N 0.18μg·m L-1,P0.025μg·m L-1;N 0.36μg·m L-1,P 0.050μg·m L-1;N 0.72μg·m L-1,P 0.100μg·m L-1;N 3.60μg·m L-1,P 0.500μg·m L-1),通过测算比生长速率、生长曲线、竞争抑制参数,研究了不同氮磷质量浓度对普通小球藻(Chlorella vulgaris)和鱼腥藻(Anabaenasp.strain PCC)生长和种间竞争的影响。结果表明,在单种培养体系中,普通小球藻和鱼腥藻的最大藻细胞数量均随氮磷质量浓度的增加而增加,最大藻细胞数量分别为198.9×105 cells·m L-1和424.8×105 cells·m L-1;氮磷质量浓度对藻类的竞争能够产生明显影响,在共培养体系中,鱼腥藻的最大藻细胞数量表现为:中高氮磷组(208.9×105 cells·m L-1)>中低氮磷组(98.3×105 cells·m L-1)>高氮磷组(64.7×105 cells·m L-1)>低氮磷组(45.3×105 cells·m L-1)。同时,种间竞争抑制参数的测算结果表明,4组氮磷质量浓度下鱼腥藻对普通小球藻的竞争抑制参数(α)分别为2.599、0.564、0.772、1.618,普通小球藻对鱼腥藻的竞争抑制参数(β)分别为0.434、0.321、0.466、-8.899,鱼腥藻对普通小球藻的竞争抑制参数(α)均大于普通小球藻对鱼腥藻的竞争抑制参数(β);低氮磷质量浓度时,鱼腥藻对普通小球藻的竞争抑制参数(α)最大,为2.599;中高氮磷质量浓度时,普通小球藻对鱼腥藻的竞争抑制参数(β)最大,为0.466。根据Lotka-Volterra竞争模型中的两物种竞争结局可初步判断,低、中高氮磷、高氮磷质量浓度时,鱼腥藻在竞争中占优势;中低氮磷质量浓度时,鱼腥藻和普通小球藻稳定共存。

H_2O_2与UV-C灭藻的协同效果研究及工程实验

研究了UV-C/H2O2催化氧化去除鱼腥藻PCC7120的效果,探讨了各种因素如c(H2O2),pH,辐照度及反应时间对灭藻率的影响.结果表明,H2O2对UV-C(紫外线C波段辐照)灭藻具有协同作用,UV-C/H2O2高级氧化体系对鱼腥藻PCC7120具有很强的氧化能力.在藻液中c(H2O2)为1 mmol/L,反应温度为25℃,pH为6.8,紫外线辐照度0.54 mW/cm2及反应20 min的条件下,受试藻种的灭活率5 d后可以达到85%以上.将H2O2与浸没式UV-C流动除藻装置结合进行流动式的灭藻实验,灭藻效果显著,鱼腥藻PCC7120体内的SOD酶和POD酶的活性及C-PC藻蓝蛋白、叶绿素a的含量都有大幅度的下降,且灭活后的蓝藻不会重新生长.

鱼腥藻sp.PCC 7120液泡的诱导和分离

将蓝藻培养于含 0 .0 5 mol/ L Na Cl的液体培养基 ,3d后细胞结构改变 ,出现无色透明区 .将此材料经溶菌酶处理形成原生质球 ,然后降低渗透压 ,原生质球破裂 ,液泡释放 .此液泡为极为标准的园球状 ,完全透明 ,泡体内无可辩物质 .电镜检查表明为一个单一膜所包围 ,泡内没有内囊体等细胞内物质 ,该膜亦显示典型三明治状单位膜结构 .

人表皮生长因子(hEGF)基因在蓝藻中的表达

人表皮生长因子 (hEGF)是由 5 3个氨基酸组成的蛋白 ,在临床上内服与外敷可促进内外表皮细胞的生长。将人工合成的hEGF基因连接到质粒pRL_489上 ,位于启动子psbA下游。验证连接成功后 ,用三亲接合转移方法将载体pRL_hEGF导入聚球藻Synechococcussp .PCC 70 0 2和鱼腥藻Anabaenasp .PCC 712 0。由于pRL_hEGF没有能在单细胞蓝藻中自主复制的复制子 ,通过筛选 ,hEGF在聚球藻 70 0 2中是整合到蓝藻染色体上进行表达的。用PCR扩增的方法在两种转基因藻中均检测到hEGF基因的存在。放射免疫分析证明 ,hEGF基因在两种转基因藻中均得到了表达。而且 ,在聚球藻 70 0

用于微藻培养的气升式光生物反应器

基于微藻光自养培养特性 ,构建了具有较大面积体积比的 15 L内外光源相结合的气升式光生物反应器 ,考察了两种不同形态藻细胞培养体系中 ,光强随细胞浓度及光程距离衰减的规律 ,得到了描述光衰减的数学关系式 ,即在鱼腥藻 712 0培养体系中为 I=I0 exp[- (0 .0 131+0 .987OD750 )·L],在聚球藻 70 0 2培养体系中为 I=I0 exp[- (- 0 .0 2 39+0 .0 777OD750 )·L],并据此对培养过程中光强沿反应器径向的动态分布情况进行了估算。在该反应器中进行了鱼腥藻 712 0和聚球藻 70 0 2两种蓝藻的光自养培养 ,藻细胞培养终密度分别达到 1.5 3g/ L和 3.4g/ L ,体积产率分别为 0 .31g L-1d-1和 0 .5 7g L-1d-1。

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)基因在鱼腥藻中的克隆

为了将rhG-CSF基因在鱼腥藻PCC7120中克隆,用于制备口服制剂,利用DNA重组技术,在不改变阅读框的前提下,将hG-CSF基因进行突变,并插入到pUC-19载体上,构建中间载体pUC-G-CSF;将pUC-G-CSF插入到pRL-489的启动子PpsbA的下游,构建穿梭表达载体pRL-G-CSF;通过三亲接合转移方法,将pRL-G-CSF转入丝状体蓝藻鱼腥藻PCC7120内。本试验得到了有抗生素抗性的鱼腥藻,并用PCR技术检测到rhG-CSF基因在转基因鱼腥藻中存在。

鱼腥藻Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

随着更多蓝藻全基因组序列测定完成,蓝藻基因工程研究现已进入后基因组时代。2001年Kaneko等完成了鱼腥藻7120全基因组序列测定,随后人们利用生物信息学的方法对其中一些基因的功能进行了预测,包括II型果糖1,6二磷酸醛缩酶(FBA)基因,但该基因是否编码II型果糖1,6二磷酸醛缩酶及该产物的相关酶学特性至今尚未见报道。通过PCR克隆到鱼腥藻7120中预测的II型FBA基因,插入到质粒pET32a的相应位点,构建成原核表达载体pETFBAII。蛋白电泳结果显示,重组蛋白的表达量占总蛋白含量的23.4%,与蛋白分子标记相比,其分子量约为40kDa。酶学活性测定结果表明,其蛋白粗提物的比活力为11.8U(mgprotein)-1,具有标准II型FBA活性。证实了Cyanobase中关于该基因功能的预测,也为进一步研究该基因表达产物的生理生化特性及功能提供了重要资料。

启动子Pcpcβ提高鱼腥藻7120中hGM-CSF基因表达效率的研究

利用聚球藻7002中编码藻蓝蛋白基因(cpcβ)的启动子(Pcpcβ),替代穿梭表达载体pDC-GM中的启动子PpsbA,启动外源人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因在鱼腥藻7120中的表达。蛋白免疫印迹证实,在含Pcpcβ启动子的cGM藻株中,hGM-CSF基因的表达水平比原先构建的含PpsbA启动子的GM藻株中提高了90%,且该基因的高效表达对宿主细胞的生长未产生明显影响。结果表明,对于在蓝藻中表达hGM-CSF基因而言,Pcpcβ启动子可能是较适宜的强启动子之一。

TNF_α基因在鱼腥藻 71 2 0中的表达及其产物的亲和层析纯化

用转入TNF_α基因并稳定表达了 4年多的丝状体蓝藻———鱼腥藻 712 0 (Anabaenasp .PCC 712 0 ) ,研究比较了在培养液中氮源 (NaNO3 )和碳源 (NaAc)对转基因藻生长和TNF_α基因的不同影响。氮源能稳定外源蛋白的表达 ,而碳源则影响细胞壁的合成。通过比较几种不同的破碎细胞的方法 ,发现超声破碎得到的可溶性总蛋白含量和TNF_α含量均要比冻融法高出 1倍左右 ,经过细胞破碎、硫酸铵分级沉淀、常压离子交换液相层析后 ,除去杂蛋白及大量容易堵柱的糖类等物质 ,最后通过亲和柱层析 ,分离出了纯的目标蛋白———重组肿瘤坏死因子 (TNF_α)。经凝胶电泳鉴定为单一的谱带 ,分子量为

应用细胞合成计量关系模型分析鱼腥藻7120的混合营养生长

根据文献中鱼腥藻细胞大分子的含量和组成情况 ,计算了细胞合成所需要的小分子单体和前体代谢物的量 ,得到代谢意义上的细胞生物合成计量关系 .利用此计量关系模型 ,对鱼腥藻 712 0细胞在气升式光生物反应器中光自养和混合营养生长的对数生长阶段进行了代谢通量分析 .结果表明 ,葡萄糖的利用影响了细胞初级碳代谢的流动状况 ,混合营养生长过程比光自养生长过程磷酸戊糖途径氧化性分支的反应程度明显加强 .随着培养的进行 ,葡萄糖被细胞用作碳源的比例可能减小 ,而用作能源的比例可能增大 .图 2表 14参

鱼腥藻PCC7120基因all5292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶(biliprotein lyase)编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中获取了同源基因all5292和alr0647。同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53.4%和61.4%。随后,对这两个基因进行了初步研究。结果显示:All5292和Alr0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白(phycocyanin)或藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)β亚基上的功能。通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索。结果表明:all5292和alr0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达。

环境因子对转hGM-CSF基因鱼腥藻生长与光合的调节

以转hGM-CSF基因鱼腥藻7120为对象,分别探讨了温度、pH、光强等环境因子和外加碳、氮等基本营养源对转基因藻生长与光合活性的影响.结果表明:当基本环境因子为30℃、pH9.5和90μmol·m-2·s-1光强时,转基因藻生长最快.添加10mmol·L-1的NaHCO3或5g·L-1的葡萄糖对转基因藻的光合活性促进最大;但外加氮源却抑制了转基因藻的光合活性.

鱼腥藻PCC 7120中all3556蛋白的表达与纯化

琥珀酸半醛脱氢酶在生物体中发挥重要的生理功能。通过BLAST序列分析,发现鱼腥藻PCC 7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。实验通过常规PCR从鱼腥藻PCC 7120基因组中克隆了all3556基因,将该基因构建到p ET-28a载体上并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中表达。经过SDS-PAGE电泳,结果表明:all3556蛋白可以在该表达体系中高效可溶性表达。利用镍亲和层析纯化方法得到了纯度大于95%的all3556蛋白,蛋白收率约为27 mg/g菌体。研究为进一步阐明all3556蛋白的催化功能及机制奠定了重要基础。

鱼腥藻PCC 7120染色体上relBE同源基因的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120染色体上与relBE同源的基因asl4561和asl4562表达产物的毒素-抗毒素作用,从鱼腥藻细胞中提取总基因组DNA,设计特异引物PCR扩增目的基因asl4561和asl4562,与T载体连接后经XhoI和EcoR I双酶切并与表达载体pET28a(+)连接,由IPTG诱导表达,并在IPTG浓度和诱导时间上对asl4561基因的表达条件进行了优化.琼脂糖凝胶电泳显示扩增出了264bp的asl4561基因和213bp的asl4562基因,SDS-PAGE检测表明成功表达出15.65kD和13.55kD的两蛋白,当诱导温度28℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间6h时,asl4561基因表达蛋白在细菌裂解液上清中表达量最大.

几种因素诱导鱼腥藻7120短藻丝体的形成

丝状蓝藻鱼腥藻 71 2 0 (Anabaena sp.PCC71 2 0 )中可成功表达外源基因 ,但其转化和表达效率不高 ,改变细胞的生理状态可能会影响外源基因的转化和表达效率。将鱼腥藻71 2 0营养藻丝体通过几种因素诱导形成短藻丝体 (具有 2 5个左右细胞 ) ,并对其光合活性进行了测定。结果表明 :红光和高温对鱼腥藻 71 2 0短藻丝体较为有效 ,且红光诱导在 48h时 ,短藻丝体细胞数占总细胞数的比例达到 85 %;DCMU单独诱导效果不明显 ,适当浓度的DCMU+红光诱导时诱导效率略有增加 ;高温以 45℃诱导 1 2 h比例最高 ,约达 87%;高温45℃诱导时 ,对数生长后期的鱼腥藻 71 2 0较易形成短藻丝体。光合活性测定结果显示 ,诱导形成的短藻丝体光合放氧速率比正常营养藻丝体的低 ,这种具有光合放氧能力的短藻丝体显示出作为表达外源基因受体的可能性。