光滑鳖甲(Anatolica polita borealis)的生物学特性研究

光滑鳖甲（Anatolica polita borealis）以成虫和不同龄期幼虫越冬，一般在4月上旬至8月中旬产卵．卵期为13～15d。根据室内饲养观察结果：光滑鳖甲幼虫龄期在8龄期仍然没有化蛹．其中1龄历期为3～4d，2龄历期为4～5d，3龄历期为7～8d．4龄历期为11～15d，5龄历期为12～14d，6龄历期为18～21d．7龄历期为20～26d，8龄历期为24～28d．本研究在建立光滑鳖甲室内人工饲养体系的基础上，对其形态特征、生活习性等生物学特性进行了观察和描述，为进一步深入研究光滑鳖甲的生物学特性和昆虫抗冻蛋白等相关研究提供理论依据．

光滑鳖甲Anatolica polita抗冻蛋白基因的发育阶段性表达以及低温对其表达的影响

【目的】光滑鳖甲是广泛分布于新疆荒漠地区的一种拟步甲科(Tenebrionidae)昆虫,它能够通过抗冻蛋白的表达从而在长时间低温和剧烈的温度变化等环境条件下生存。研究光滑鳖甲抗冻蛋白基因(Apafp)在不同发育阶段表达差异和冷胁迫对其表达的影响。【方法】通过实时定量PCR方法对Apafp752和Apafp914两种抗冻蛋白基因的mRNA水平变化规律进行了研究。【结果】随着幼虫龄期的增大,Apafps mRNA水平逐渐增加,至8～9龄幼虫阶段达到最高约为小龄幼虫的7～8倍,蛹期时则显著降低。血淋巴液的渗透浓度值也呈现相同趋势。【结论】发育阶段的变化是对光滑鳖甲抗冻蛋白基因表达的重要调节因素。在低温胁迫下4～6龄幼虫afps的表达显著提高,说明冷胁迫能促进幼虫afps的累积。结合Apafps基因表达和低温存活率可以推测光滑鳖甲大龄幼虫可能是一种过冬虫态。

荒漠昆虫光滑鳖甲的耐寒性季节变化及其生理机制

光滑鳖甲Anatolica polita borealis生活于温差大的新疆荒漠环境,为探讨其耐寒性及耐寒机制,本研究测定了其3-9月份成虫在-10℃的耐寒性、过冷却点(SCP)、含水量、甘油含量和血淋巴热滞活性(thermal hysteresis activity,THA)以及冷驯化对增强光滑鳖甲成虫耐寒性的效果,还测定了光滑鳖甲不同发育阶段幼虫的SCP。结果表明:光滑鳖甲成虫的耐寒性和SCP具有明显的季节性变化,3月初SCP为-12.5℃,7月为-6℃,9月底为-13.6℃。4℃冷驯化能够提高光滑鳖甲成虫在-10℃的存活率,未驯化组在40min的存活率为50%,而驯化2h的为70%,驯化24h的为90%。虫体含水量在夏季有显著降低,3月、7月和9月结合水与自由水的比值分别为10.8∶1,2.6∶1和5.4∶1。成虫甘油含量与SCP的回归方程为y=-0.6204x-5.681,R2=0.7714。成虫血淋巴THA与过冷却点的回归方程为y=-5.26x-1.713,R2=0.9049。血淋巴THA比甘油浓度更能影响过冷却点降低的程度。随着幼虫的发育,其SCP逐渐降低。结果提示,光滑鳖甲通过提高结合水与自由水的比值、增加抗冻蛋白和甘油的含量使虫体保持较低的SCP,因而具有较高的耐寒性。

光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的昆虫热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)基因的保守序列设计引物,利用PCR结合RACE扩增的方法,获得新疆荒漠昆虫光滑鳖甲Anatolica polita borealis热休克蛋白70基因,命名为APhsp70(GenBank注册号为EF569673)。测序结果表明,序列长为2 092 bp,由核酸序列推演出的蛋白质分子量为70 kD,含653个氨基酸残基。基因结构分析表明APhsp70不含内含子序列。通过Northern blotting和半定量RT-PCR技术研究昆虫在受到不同温度胁迫时该基因的表达规律,结果表明:在45℃处理时,昆虫体内该基因的表达水平显著上升。并且,当机体受到-5℃低温胁迫并在室温恢复15 min后APhsp70的表达量也显著升高;但是4℃和-10℃低温处理组APhsp70的表达未见明显变化。

新疆荒漠昆虫光滑鳖甲cDNA文库的构建及功能基因筛选

以过冬后早春的新疆荒漠拟步甲属昆虫光滑鳖甲(Anatolica Polita borealis)成虫为研究材料,应用SMARTTM cDNA Library Construction技术,通过总RNA提取,反转录合成cDNA,定向构建至噬菌体载体λTripEx2,经体外包装构建了光滑鳖甲的cDNA表达文库。测试结果表明库容量为2.2×106,重组率为84.8%。通过对cDNA文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得28个光滑鳖甲表达序列标签(ESTs),包括17个EST(60.7%)与NCBI中已注册的已知功能基因相似性较高,另外的11个EST(39.3%)则没有发现与之相似的序列,推测可能是功能未知的新基因。同时,利用PCR扩增文库技术从cDNA文库中克隆获得了光滑鳖甲的抗冻蛋白基因,初步表明光滑鳖甲cDNA表达文库构建的成功,为深入研究新疆荒漠昆虫的抗冻机理及发现新的昆虫功能基因奠定了基础。

β-actin基因在荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲中表达的稳定性研究

为检测生活习性截然相反的两种荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲的β-actin基因在不同温度下的表达是否稳定,对不同温度处理和不同季节采集的昆虫提取总RNA反转录合成cDNA后,进行荧光实时定量PCR检测。以Ct值作为β-actin基因表达水平的测定值。通过方差分析显示:光滑鳖甲的β-actin基因在不同季节无显著差异,而小胸鳖甲则表现出β-actin基因表达的季节性差异;在不同温度处理条件下,光滑鳖甲β-actin基因表达比小胸鳖甲的要稳定。研究认为β-actin可作为研究光滑鳖甲不同温度下基因表达的内参基因,而β-actin则不适合用做研究小胸鳖甲在不同温度下基因表达的内参基因。

细菌诱导光滑鳖甲幼虫抑制差减cDNA文库的构建与分析

本研究以光滑鳖甲幼虫的cDNA为材料,应用抑制差减杂交（Suppression Subtractive Hybrriization,SSH）技术构建细菌诱导的光滑鳖甲幼虫抑制差减cDNA文库,并利用反向Northern杂交技术获得差异基因.结果表明,随机挑取的阳性克隆的大小均为20（0～750 bp,符合差减文库PCR产物片段的大小.通过斑点杂交技术共筛选出940个差异基因片段,对其克隆、测序及同源性分析后鉴定出70种编码蛋白的基因ESTs序列,所得ESTs序列主要涉及免疫防御、代谢过程、生长发育类等相关基因.细菌诱导光滑鳖甲幼虫抑制差减cDNA文库的构建,为进一步克隆光滑鳖甲免疫抗菌相关基因及其免疫防御机制的研究奠定了基础.

光滑鳖甲抗冻蛋白基因(AP-AFP060116)表达规律的研究

研究以克隆的光滑鳖甲抗冻蛋白基因(AP-AFP060116,Apafp)为目的基因,采用半定量RT-PCR技术,首次探讨了该基因在不同低温处理下的表达规律。半定量RT-PCR实验结果表明光滑鳖甲成虫经历长时间冷驯化后,体内Apafp基因的表达水平增高。计算半定量RT-PCR产物电泳图像的灰度值,结果显示在低温处理的第5 d,昆虫体内Apafp基因的表达水平与对照组相比差异显著(P<0.05)。快速冷驯化实验结果显示,处理组与对照组昆虫体内Apafp基因的表达水平没有明显的差异。同时使用Southern blot技术证明光滑鳖甲抗冻蛋白基因家族的存在。

新疆荒漠再次发现畸形拟步甲二例

本文介绍两例畸形甲虫。一例是触角畸形的光滑鳖甲成虫,发现于古尔班通古特沙漠南缘(新疆昌吉五家渠),为第三次在这一地点发现畸形昆虫。另一例是左侧中胸和后胸体节合并的畸形中华齿刺甲幼虫,发现于新疆大学校园。对光滑鳖甲的畸形触角,使用体视显微镜和电子显微镜进行了形态特征的观察。并且测量了触角各节的长度、宽度和横截面积。其结果显示,在触角第5节后,畸形触角的尺寸显著小于正常触角的相应节。

光滑鳖甲抗菌肽的原核表达条件优化及其抗菌活性

【目的】本研究旨在探索光滑鳖甲Anatolica polita borealis抗菌肽Ap AMP1015的最佳原核表达条件及其抗菌活性。【方法】利用生物信息学方法对得到的Ap AMP1015基因序列和蛋白结构进行分析,运用原核表达技术表达Trx A-Ap AMP1015融合蛋白,通过Western blot方法鉴定蛋白,并利用亲和层析的方法获得纯化的Trx A-Ap AMP1015融合蛋白,抑菌圈实验验证蛋白抗菌活性。【结果】克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP1015,其开放阅读框长387 bp,编码128个氨基酸,其中包含由19个氨基酸组成的信号肽和75个氨基酸组成的成熟肽。NCBI数据库同源序列比对结果显示该蛋白属Coleoptericin抗菌肽家族。确定了蛋白表达的最佳条件:0.1 mmol/L IPTG 150 r/min 25℃诱导4 h。肠激酶切割后的Ap AMP1015能够有效抑制大肠杆菌Escherichia coli的生长。【结论】克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP1015,获得了其编码蛋白的最优表达条件,研究发现Ap AMP1015能够有效抑制大肠杆菌的生长。本研究为光滑鳖甲抗菌肽Ap AMP1015的应用和进一步研究奠定了基础。

光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin-FA72的克隆、表达及功能验证

【目的】本研究旨在对光滑鳖甲Anatolica polita borealis丝氨酸蛋白酶抑制剂基因进行克隆及表达分析,以验证光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能。【方法】利用PCR和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本性质进行预测和分析,同时构建其编码产物的系统进化树;构建光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白重组表达载体,表达、纯化蛋白进行功能验证。【结果】获得光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Ap Serpin-FA72(Gen Bank登录号:MF188125),其基因编码序列长为1 176 bp,编码由391个氨基酸残基组成的多肽,蛋白理论分子量为43.7 k D,理论等电点为5.14,包含一个由21个氨基酸组成的信号肽。As Serpin-FA72属亲水蛋白,分泌到胞外发挥作用,可能具有胁迫应答的功能,与赤拟谷盗Triboloum castaneum Serpin的同源性最高。纯化得到的融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72大小约为63.7 k D。功能验证表明,重组蛋白Trx A-Ap SerpinFA72对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性均有抑制作用。【结论】光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达产物对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性具有抑制作用,表明其可能对消化类丝氨酸蛋白酶活性起抑制作用,对其功能活性的验证有助于深入研究Ap Serpin-FA72与丝氨酸蛋白酶之间的关系。

光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白ApPGRP的表达与功能分析

【目的】旨在研究光滑鳖甲Anatolica polita肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)基因ApPGRP表达模式及其对下游免疫相关基因的表达调控,以及重组蛋白ApPGRP与细菌的结合能力。【方法】构建原核表达载体pET-28a-ApPGRP,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达并纯化重组蛋白His-ApPGRP,分别测定其与金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和肽聚糖(peptidoglycan, PGN)的结合能力。金黄色葡萄球菌S.aureus刺激后,利用qRT-PCR检测光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP、抗菌肽基因ApAttacin2和ApAttacin1、防御素基因ApDefensin、丝氨酸蛋白酶基因ApSP和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin等免疫相关基因的表达水平;采用RNAi技术沉默光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP基因的表达,并利用qRT-PCR分别检测RNAi处理以及RNAi后再用S.aureus刺激时幼虫体内上述基因的表达水平变化。【结果】通过原核表达获得了重组蛋白His-ApPGRP,其具有结合金黄色葡萄球菌和肽聚糖的能力。注射金黄色葡萄球菌后,检测的光滑鳖甲6龄幼虫免疫相关基因(ApSP除外)的表达都显著上调;RNAi沉默光滑鳖甲6龄幼虫ApPGRP后,其他免疫相关基因表达量均显著降低,其响应金黄色葡萄球菌刺激后的表达量也显著低于对照组。【结论】这些结果表明,ApPGRP在光滑鳖甲免疫防御中起着识别外源微生物,激活信号通路并调控抗菌肽表达的作用。

荒漠昆虫光滑鳖甲(鞘翅目:拟步甲科:鳖甲族)的人工饲养方法

为了解决深入研究荒漠甲虫环境适应机制时所遇到的各发育阶段试虫材料短缺的问题,本文介绍了饲养拟步甲科鳖甲族昆虫光滑鳖甲Anatolica polita Kaszab的有效方法。将早春季节在野外采集的成虫饲养在2 L的塑料烧杯中,收集卵。用玻璃培养皿孵育卵;用改装的盛有沙土的矿泉水瓶单只饲养3龄以上幼虫,以防止幼虫自相残杀。为保持幼虫饲养瓶内的适当湿度,在瓶子底部加入72 mL的水,再装入800 g沙子,借助毛细现象,形成渐变式含水基质,在最上层的干沙表面加麦麸以饲养幼虫。如需观察计数,可将预蛹、蛹和初孵成虫置于玻璃培养皿中培养。采用此方法饲养的光滑鳖甲可顺利完成生活史,其卵的孵化率为68.67%±2.45%,1～2龄幼虫的存活率为82.95%±7.72%,3～9龄幼虫的存活率为73.80%±4.95%;预蛹、蛹和幼嫩成虫的存活率分别为84.68%±2.35%、88.45%±2.75%和90.56%±4.20%。该方法可以有效实现光滑鳖甲的室内饲养,并可用于其他一些沙栖拟步甲科昆虫的人工饲养。

荒漠甲虫总RNA提取方法的比较与分析

目的:昆虫总RNA由于其自身结构特点,存在与动物植物完全不同的电泳条带,本文通过对比探索光滑鳖甲总RNA提取的最优方案。方法:实验采用5龄光滑鳖甲幼虫,利用TRIzol、CTAB、热酚法、及BioTeKe Kit、TianGen Kit试剂盒提取方法提取光滑鳖甲总RNA。结果:(1)所采用的实验方法提取的光滑鳖甲总RNA均呈现出与植物、哺乳动物血细胞、哺乳动物组织样总RNA不同的条带,28S弱于18S条带亮度;(2)TRIzol法、CTAB法、改进热酚法所得光滑鳖甲总RNA条带清晰、完整,D260/D280值为1.89～1.98,D260/D230值为1.94～2.09,纯度较好;(3)TRIzol法RNA提取得率为304.3～365.4μg/g,BioTeKe Kit RNA提取得率为73.38～128.22μg/g。结论:综合所有参数,所选取的方法中,TRIzol法可获得高质量、高产量的光滑鳖甲总RNA,可用于RT-PCR、文库构建等高要求RNA的提取。

光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白的生物信息学分析

[目的]预测光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白的结构与功能。[方法]采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析,同时构建其编码产物的系统进化树。[结果]此蛋白的理论分子量为21.882 k D,包含一个由20个氨基酸组成的信号肽,属亲水蛋白,分泌到胞外发挥作用,可能具有信号转导和响应胁迫与免疫反应的功能,与赤拟谷盗的同源性最高,具有能够与肽聚糖结合的保守的PGRP结构域和一个Ⅱ型酰胺酶结构域。[结论]光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白Ap PGRP-FD1基因克隆成功,生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测可为深入研究ApPGRP-FD1提供理论指导。

荒漠甲虫光滑鳖甲和小胸鳖甲抗冻蛋白基因及其3'-UTR的序列分析

拟步甲科昆虫光滑鳖甲Anatolica polita Kaszab和小胸鳖甲Microdera punctipennis Kaszab分别是新疆准噶尔盆地荒漠地区的广布种和特有种。它们的生活习性有很大差异,光滑鳖甲白天活动,且活动范围广,而小胸鳖甲喜阴避光夜晚活动,活动范围小,但在两者体内都发现有多拷贝的抗冻蛋白基因,并且抗冻蛋白基因在夏季也有表达。为了比较这两种昆虫的抗冻蛋白序列以及不同时期表达的抗冻蛋白序列的差异情况,本研究分别以光滑鳖甲和小胸鳖甲的过冬和夏季成虫为材料,根据已克隆的抗冻蛋白基因序列设计通用引物,扩增新的抗冻蛋白基因及其3'-非翻译区(3'-UTR)。序列分析结果表明,无论是冬季还是夏季表达的抗冻蛋白在两种昆虫中都具有拟步甲科昆虫抗冻蛋白的特点,即含有不同数量的"TCTXSXXCXXAX"12个氨基酸的重复序列;光滑鳖甲抗冻蛋白基因的变异性大于小胸鳖甲,并且在重复基序的保守位点都有突变现象。小胸鳖甲抗冻蛋白在C末端有较大变异。光滑鳖甲抗冻蛋白基因的3'-UTR区变异较大,而小胸鳖甲抗冻蛋白基因的3'-UTR区几乎没有变异。推测两种昆虫抗冻蛋白及抗冻蛋白基因3'-UTR的变异性可能与抗冻蛋白的表达调控以及昆虫对微环境的适应性有关。