雄激素含量测定用蛋白微阵列的制备

利用分子生物学技术对鼠雄激素受体结合域(rARLBD)重组表达,结合新兴的蛋白质微阵列技术建立了一种快速无污染的检测方法,用于临床雄激素检测及新药发现。实验将编码ARLBD的cDNA片段(888bp)插入到含有多聚组氨酸标签的表达载体pET32a中构建了表达质粒pET32a/AR,并将其转化到大肠杆菌BL21中。经IPTG低温诱导,得到高效表达的可溶性ARLBD融合蛋白产物,并通过NiNTA凝胶亲和吸附纯化。将纯化得到的ARLBD使用芯片点样仪固定到硅烷化-多糖表面片基,制备得到ARLBD蛋白质微阵列。实验得到的特异性结合曲线表明在微阵列上的受体蛋白能够保持功能构像。通过Scatchard方程计算得到微阵列上ARLBD与荧光标记的睾酮结合的Kd值为5.32nmol/L。浓度依赖性标准曲线表明这一方法有较高的灵敏度,最低检测限达1pmol/L。应用这一方法对224例健康中国老年人血清雄激素水平进行了测定,研究证明了该方法的可靠性,并首次提供了一定样本量的我国老年人血清活性雄激素水平的参考值。这一技术的建立将为生物工程技术产品与临床检测和分子水平化合物筛选有效地结合提供一条新的途径。