HPLC双波长法测定四味穿心莲散中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量

建立HPLC双波长法同时测定四味穿心莲散中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量。采用XBridge C_(18)色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以甲醇-水(52∶48)为流动相,流速1.0 mL·min^(-1);柱温25℃;进样量10μL,检测波长分别为225 nm(穿心莲内酯)和254 nm(脱水穿心莲内酯)。穿心莲内酯浓度在12.7375μg·mL^(-1)~509.5μg·mL^(-1)范围内,线性良好(r^(2)=0.9996);脱水穿心莲内酯浓度在3.4μg·mL^(-1)~136μg·mL^(-1)范围内,线性关系良好(r^(2)=0.9997)。穿心莲内酯加样回收率平均为98.8%,RSD为1.0%;脱水穿心莲内酯回收率平均为99.9%,RSD为08%。该方法快捷、灵敏、准确、可靠,可用于四味穿心莲散中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯2个有效成分的同步测定,为四味穿心莲散的质量控制和评价提供科学依据。

穿心莲内酯生物合成与调控的研究进展

穿心莲内酯是中药材穿心莲的主要活性成分,具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆等功效,临床上主要用于治疗小儿肺炎和上呼吸道感染等疾病。近年来,由于环境因素长期影响、品种纯度不高以及优良品种选育工作滞后等原因,很大程度上限制了穿心莲的品质提升。在穿心莲药材质量评价中,穿心莲内酯的含量是一项非常重要的指标,通过解析穿心莲内酯生物合成的分子机制及积累规律,有助于提升穿心莲药材质量。该文综述了穿心莲内酯的生物合成途径与分子调控机制,穿心莲内酯的生物合成主要分为两大阶段,即穿心莲内酯前体的合成阶段和穿心莲内酯合成的修饰阶段,其中前体合成研究已经较为清楚,但有关穿心莲内酯合成修饰阶段的途径和关键酶的挖掘还处于空白水平,需进一步研究。通过从环境因素和栽培措施两个层面对穿心莲内酯合成积累的关键影响因子进行挖掘,有利于建立完善的高品质穿心莲种植体系。此外,对调控穿心莲内酯生物合成的研究进展进行总结和展望,可为穿心莲药材品质提升提供参考。

穿心莲内酯对角膜镰刀菌生物膜形成及黏附能力的影响

目的探讨中药有效成分穿心莲内酯对角膜镰刀菌生物膜形成及其黏附能力的影响。方法采用结晶紫染色法评估不同浓度穿心莲内酯作用下临床多重耐药角膜镰刀菌株的初始黏附及生物膜形成能力。结果与未加药对照组相比,培养2 h、4 h,抑制50%的镰刀菌孢子黏附的穿心莲内酯浓度分别为64、512μg/mL;培养24 h,角膜镰刀菌表现出强生物膜形成能力,穿心莲内酯在2048μg/mL下可抑制其50%的生物膜形成。结论穿心莲内酯可显著抑制角膜镰刀菌的初始黏附,并对其生物膜形成有一定的抑制作用。

穿心莲内酯调节cGAS-STING信号通路对银屑病小鼠的治疗作用

目的 探究穿心莲内酯(Andro)调节GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激物(cGAS-STING)信号通路对银屑病小鼠的治疗作用及机制。方法 90只BALB/c小鼠分为对照组(Control组),模型组(Model组),穿心莲内酯低、中、高剂量组(Andro-L、M、H组,10、30、50 mg·kg^(-1)·d^(-1) Andro)和穿心莲内酯高剂量+STING激活剂DMXAA组(Andro-H+DMXAA组,50 mg·kg^(-1)·d^(-1) Andro+5 mg·kg^(-1)·d^(-1) DMXAA)。除Control组外,其余组小鼠背部施用咪喹莫特(IMQ)建立银屑病小鼠模型。观察小鼠银屑病面积并进行严重程度指数(PASI)评分,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-23、IL-17A、干扰素(IFN)-γ和IFN-β水平,苏木素-伊红(HE)染色和甲苯胺蓝染色测定表皮厚度和肥大细胞数,免疫荧光染色检测Ki-67、CD4阳性细胞表达率,RT-q PCR检测c GAS和STING m RNA表达水平,免疫印迹实验检测c GAS、STING、干扰素调节因子3(IRF3)、p-IRF3蛋白水平。结果 与Control组相比,Model组小鼠背部皮肤出现严重的红斑、鳞屑,有大量的炎性细胞浸润;抓挠次数、PASI评分、表皮厚度、肥大细胞数量、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-23、IL-17A、IFN-γ和IFN-β水平、Ki-67和CD4阳性表达率、c GAS和STING m RNA和蛋白表达水平及IRF3磷酸化水平升高(P<0.05)。与Model组相比,Andro-L组、Andro-M组和Andro-H组小鼠皮肤红斑、鳞屑、炎性细胞浸润现象减轻;抓挠次数、PASI评分、表皮厚度、肥大细胞数量、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-23、IL-17A、IFN-γ和IFN-β水平、Ki-67和CD4阳性表达率、cGAS和STING mRNA和蛋白表达水平及IRF3磷酸化水平呈剂量依赖性降低(P<0.05);STING激活剂DMXAA逆转了穿心莲内酯对银屑病小鼠的保护作用(P<0.05)。结论 穿心莲内酯可通过抑制cGAS-STING信号通路减轻炎症反应,改善小鼠银屑病症状。

穿心莲内酯联合多柔比星介导ROS依赖性DNA损伤诱导乳腺癌细胞死亡

目的探讨穿心莲内酯联合多柔比星对乳腺癌细胞凋亡的影响及其分子机制。方法乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7分别单独使用多柔比星、穿心莲内酯或联合两药处理后,采用MTT实验、克隆形成实验分别检测细胞增殖能力、克隆形成能力。采用流式细胞术(PI染色和DCFH-DA染色)检测细胞死亡情况和细胞ROS水平,Western blot检测乳腺癌细胞的γ-H2AX、PARP和α-tubulin蛋白表达,添加ROS清除剂NAC进一步检测ROS对细胞DNA的影响。构建乳腺癌裸鼠异位移植瘤模型,单独使用多柔比星、穿心莲内酯或联合两药处理后,检测裸鼠体重、肿瘤体积,通过HE病理染色、Ki-67-IHC染色分别检测细胞死亡和肿瘤细胞增殖能力,验证联合用药在动物体内的治疗效果。结果与单独用药组相比,联合用药组乳腺癌细胞的增殖率、存活率和克隆形成能力均降低(均P<0.05),细胞ROS水平升高(P<0.001),γ-H2AX蛋白表达升高并诱导PARP蛋白发生裂解;与联合用药组相比,NAC+联合用药组的细胞存活率升高(P<0.05),而细胞ROS水平降低(P<0.001)、γ-H2AX蛋白表达减少。在动物实验中,不同处理组的裸鼠体重差异无统计学意义(均P>0.05);与单独用药组相比,联合用药组裸鼠肿瘤体积较小、肿瘤细胞死亡更多、Ki-67表达水平较低(均P<0.05)。结论穿心莲内酯能增强多柔比星抑制乳腺癌细胞增殖的能力。穿心莲内酯通过增加ROS水平加重细胞DNA损伤可能是诱导乳腺癌细胞死亡的机制。

穿心莲内酯靶向Akt信号干预HIV感染T细胞的效率研究

目的探讨穿心莲内酯靶向Akt信号干预人类免疫缺陷病毒(HIV)感染T细胞的效率。方法培养Jurkat T细胞,用WST-1试剂检测穿心莲内酯干预对Jurkat T细胞活性的影响。将Jurkat T细胞分为空白对照组、穿心莲内酯组、LY294002组(PI3K抑制剂)及穿心莲内酯联合LY294002组。各组药物分别干预24 h后,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组细胞PI3K、Akt mRNA相对表达量,采用Western blotting检测各组细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量。制备HIV假病毒,用假病毒感染各组细胞,萤光素酶系统检测假病毒感染Jurkat T细胞的效率。结果WST-1试剂检测结果显示,随着穿心莲内酯浓度增加,Jurkat T细胞活力降低(P<0.05)。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,穿心莲内酯降低Jurkat T细胞PI3K及其下游Akt mRNA相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量(P<0.05)。HIV假病毒感染实验结果显示,穿心莲内酯降低HIV假病毒感染Jurkat T细胞的效率,联合组比单独组的抑制效果更好(P<0.05)。结论穿心莲内酯可能通过PI3K降低其下游Akt的活化,从而减少HIV假病毒在Jurkat T细胞间的传播及进入细胞的机会,降低其感染Jurkat T细胞的概率。

穿心莲内酯磺化物注射液解热镇痛抗炎作用研究

为探究穿心莲内酯磺化物注射液的解热、镇痛、抗炎作用,将SD大鼠和KM小鼠分别随机分为空白组,阳性药穿心莲注射液组,穿心莲内酯磺化物注射液高、中、低剂量组。通过皮下注射干酵母诱导大鼠发热模型探究其解热作用;通过冰醋酸致小鼠扭体法探究其镇痛作用;通过二甲苯诱导小鼠耳肿胀法及λ-角叉菜胶诱导大鼠足肿胀法探究其抗炎作用。结果表明,穿心莲内酯磺化物注射液可显著抑制干酵母所致发热大鼠的肛温上升;显著抑制冰醋酸所致小鼠疼痛,减少扭体次数;显著降低二甲苯致小鼠耳肿胀,减少肿胀度;显著抑制λ-角叉菜胶致大鼠足肿胀,减少肿胀度。由此可知,穿心莲内酯磺化物注射液具有明显的解热、镇痛、抗炎的作用。

穿心莲内酯磺化物注射液对猪的安全性评价

本试验旨在考察肌内注射穿心莲内酯磺化物注射液对靶动物猪的安全性。选取32头健康仔猪,随机分为空白对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组,3个剂量组分别以25 mg/kg、15 mg/kg、5 mg/kg剂量肌内注射给药,连续3 d,每天1次,观察各剂量组猪给药后的临床表现,考察穿心莲内酯磺化物注射液对猪血液生理、生化指标的影响,试验结束时,对高剂量组及空白对照组试验猪进行剖检及组织病理学检查。结果显示,连续给药后7 d,与空白对照组相比,各剂量组猪临床表现正常,血液生理、生化指标均无显著性差异,各脏器组织均无明显的与药物有关的病理变化。表明通过肌内注射穿心莲内酯磺化物注射液对靶动物猪无明显不良反应,安全性较高。

穿心莲内酯自微乳给药系统制备

目的制备穿心莲内酯自微乳给药系统。方法根据平衡溶解度、辅料配伍、伪三元相图确定辅料比例范围。以广藿香油占比、Labrasol ALF与Tween 80比例、Km为影响因素,平衡溶解度为评价指标,星点设计-响应面法优化处方,再进行体外评价。结果最优处方为广藿香油、Labrasol ALF、Tween 80、Transcutol HP占比10.45%、13.28%、9.82%、66.44%,平衡溶解度为(11.95±0.04)mg/g。质量参数分别为乳化时间(20.22±0.38)s,粒径(51.70±2.91)nm,多分散指数0.27±0.02,透光率(91.21±1.58)%。自微乳给药系统冻融稳定性良好,稀释倍数、分散介质对其粒径无明显影响,在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中溶出迅速。结论自微乳给药系统可提高穿心莲内酯溶解度、溶出速率。

穿心莲内酯减轻脂多糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡机制

目的探讨穿心莲内酯(AG)对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症肾小管上皮细胞(HK-2细胞)铁死亡的影响及其作用机制。方法采用LPS处理HK-2细胞,模拟脓毒症HK-2损伤体外模型,进一步用5、10、20、40μmol/L的AG进行干预,将细胞随机分为对照组(Control)、LPS组、LPS+二甲亚砜(DMSO)组、AG组。采用CCK-8法检测细胞活力,筛选出最适LPS和AG浓度;比较各组中细胞形态变化,肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子-1(KIM-1)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平,以及铁死亡调控蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和铁蛋白(Ferritin)的表达水平,评估AG处理对细胞的保护作用。结果与Control组相比,10μg/mL LPS诱导的HK-2细胞中细胞活力及GSH含量下降,细胞皱缩、贴壁能力差,氧化产物MDA和ROS含量以及肾损伤标志物NGAL和KIM-1水平明显升高,SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低,Ferritin蛋白表达水平增高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。而在使用AG干预后,与LPS组相比,细胞活力升高,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平升高,而Ferritin蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);MDA含量和ROS荧光强度以及肾损伤标志物NGAL和KIM-1水平下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论AG对LPS诱导的HK-2细胞损伤具有保护作用,其机制可能是激活SLC7A11/GPX4通路,减少氧化应激,上调抗氧化酶活性,减轻细胞铁死亡。

穿心莲内酯介导c-SKI抑制心肌成纤维细胞转分化和心肌纤维化

目的:探讨c-SKI(cellular Sloan-Kettering Institute)蛋白表达变化对穿心莲内酯(andrgrapholide,Andr)治疗小鼠心肌纤维化的影响。方法:将18只C57雄性小鼠随机分为control组、模型组[异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)组]和ISO+Andr组,每组6只。ISO组和ISO+Andr组小鼠皮下注射ISO,control组注射生理盐水;ISO+Andr组小鼠给予Andr灌胃,ISO组和control组给予等体积生理盐水灌胃。给药8周,取心脏组织进行HE和Masson染色检测病理特征;免疫组化或Western blot实验检测c-SKI和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相关蛋白水平;qPCR检测c-SKI mRNA水平。用不同浓度Andr干预人心脏成纤维细胞(human cardiac fibroblasts,HCFBs)48 h,CCK-8实验检测细胞活力,Western blot实验检测c-SKI和ECM相关蛋白水平。用Andr最低有效剂量处理转分化细胞模型,显微镜观察细胞形态,Western blot实验检测c-SKI和ECM相关蛋白水平,qPCR检测c-SKI mRNA水平。敲减c-SKI和Andr联合处理转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的HCFBs,CCK-8实验检测细胞增殖活力,Western blot实验检测c-SKI和ECM相关蛋白水平。结果:与ISO组相比,Andr干预后小鼠心肌纤维排列整齐,心肌细胞形态基本正常,细胞膜完整,胶原容积分数显著减少(P<0.01),c-SKI的mRNA和蛋白水平显著上调(P<0.05或P<0.01),纤连蛋白1(fibronectin 1,FN1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(vimentin)和I型胶原(collagen type I,Col I)蛋白水平显著下调(P<0.01)。HCFBs经50μmol/L Andr处理48 h,细胞活力显著降低(P<0.01),FN1、α-SMA、vimentin和Col I蛋白水平显著下调(P<0.01),c-SKI表达显著上调(P<0.01)。与PBS组相比,TGF-β1组细胞数量增多,胞核固缩,细胞形态改变,细胞中FN1、α-SMA、vimentin和Col I蛋白表达显著上调(P<0.01),c-SKI表达显著下调(P<0.01);Andr干预逆转了TGF-β1对HCFBs的诱导作用。敲减c-SKI和Andr联合处理显著下调HCFBs中c-SKI表达(P<0.01),显著上调FN1、α-SMA、vimentin和Col I蛋白表达水平(P<0.05),显著增强细胞活力(P<0.05)。结论:Andr可能通过调控c-SKI表达影响TGF-β1信号通路,抑制心肌成纤维细胞增殖和ECM沉积,从而抑制心肌纤维化。

穿心莲内酯调节HMGB1/RAGE信号通路对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经功能损伤的影响

目的探讨穿心莲内酯调节高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/晚期糖基化终产物受体(RAGE)信号通路对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠坐骨神经功能损伤的影响。方法将84只大鼠随机分为对照组(生理盐水)、DPN组(生理盐水)、穿心莲内酯低剂量组(0.833 mg/kg)、穿心莲内酯高剂量组(3.332 mg/kg)、硫辛酸组(阳性对照,0.1 g/kg)、重组大鼠HMGB1蛋白(rHMGB1,8μg/kg)组、穿心莲内酯高剂量+rHMGB1组,每组12只。除对照组外,其余各组大鼠均采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素的方式构建DPN模型。造模成功24 h后,进行给药处理,每天1次,持续8周。给药结束后,检测大鼠空腹血糖、机械痛阈值、热痛阈值、坐骨神经传导速度的变化;观察大鼠坐骨神经病理变化;检测大鼠坐骨神经中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;检测大鼠坐骨神经中HMGB1、RAGE蛋白表达水平和核因子κB p65(NF-κB p65)蛋白磷酸化水平。结果与对照组比较,DPN组大鼠坐骨神经病理损伤严重,空腹血糖、热痛阈值、MDA含量及HMGB1、RAGE蛋白表达水平和NF-κB p65蛋白磷酸化水平均显著升高(P<0.05),机械痛阈值、感觉神经传导速度、运动神经传导速度、SOD活性显著降低/减慢(P<0.05);与DPN组比较,穿心莲内酯低、高剂量组和硫辛酸组大鼠上述指标均显著改善(P<0.05),rHMGB1组对应指标变化趋势与上述3个给药组相反(P<0.05);并且,rHMGB1可减弱高剂量穿心莲内酯对DPN大鼠血糖的降低作用及坐骨神经氧化应激损伤的改善作用(P<0.05)。结论穿心莲内酯可能通过抑制HMGB1/RAGE信号通路来降低血糖、抑制氧化应激,进而改善DPN大鼠坐骨神经损伤。

穿心莲不同生长发育期穿心莲内酯积累与碳氮代谢特征

【目的】明确穿心莲(Andrographis paniculata)不同生长发育期主要活性成分穿心莲内酯的积累和碳、氮代谢特征及其关系,为穿心莲优质高产栽培管理提供理论依据。【方法】根据穿心莲生长发育特点,将其物候期划分为塔型期、团棵期、拔节期、现蕾期、盛花期和花果期,分析大田条件下各生长发育期的生物量及穿心莲内酯积累和碳、氮代谢特征。【结果】穿心莲全株和茎秆生物量在盛花期开始稳定,叶片生物量在拔节期开始趋于稳定,相对生长速率和叶片生物量占比随着生长进程逐渐下降。叶片的穿心莲内酯含量在塔型期至现蕾期(营养生长期)逐渐上升,在现蕾期达峰值且保持稳定,单株穿心莲内酯产量在盛花期达最大。穿心莲内酯合成关键酶基因ApDXS、ApDXR、ApGGPS和ApCPS的表达量在团棵期上升,随后下降并趋于平稳,而基因ApHMGS和ApHMGR1在现蕾期后维持在高表达水平。穿心莲内酯合成可能主要受甲羟戊酸(MEP)途径调控,且穿心莲内酯积累滞后于基因表达。叶片和茎秆的氮含量随着穿心莲的生长进程逐渐下降,植株地上部氮积累量和茎秆氮积累量在现蕾期达最大值,而叶片的氮在现蕾期后向果实转移其积累量逐渐下降。塔型期和团棵期叶片氮同化相关酶中的谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(NAD-GDH)和异柠檬酸脱氢酶(ICDH)活性较高,同时叶片蔗糖和可溶性总糖含量也较高,随后氮同化酶活性及蔗糖和可溶性总糖含量下降,淀粉含量的变化则相反。叶片穿心莲内酯含量和单株穿心莲内酯产量与株高、生物量、地上部氮积累量和淀粉含量呈极显著正相关(P<0.01,下同),与叶片氮含量呈极显著负相关,说明促进穿心莲营养生长期生物量积累有利于提高穿心莲内酯含量和产量。【结论】现蕾期至盛花期是采收穿心莲药材的最佳时期;营养生长期是穿心莲氮同化和积累的主要时期,在该时期适当增施氮肥促进穿心莲生物量积累可提高穿心莲内酯含量和产量。

穿心莲内酯通过抑制Fas/FasL信号轴降低子宫内膜癌Ishikawa/DPP细胞对顺铂的耐药性

目的:探讨穿心莲内酯(Andro)调节脂肪酸合成酶(Fas)/脂肪酸合成酶配体(FasL)信号轴对子宫内膜癌Ishikawa细胞顺铂(DDP)耐药性的影响。方法:采用0、5、10、20μg/mL DDP分别处理Ishikawa细胞和顺铂耐药的Ishikawa/DPP细胞,0、5、10、25、50μmol/L Andro处理Ishikawa/DDP细胞,MTT法检测细胞增殖情况并为后续实验选择合适的给药剂量。将Ishikawa/DDP细胞随机分为对照组、DDP组(DDP干预)、Andro组(DDP、Andro干预)、pcDNA3.1-NC组(转染pcDNA3.1+DDP、Andro干预)、pcDNA3.1-Fas/FasL组(转染pcDNA3.1-Fas/FasL+DDP、Andro干预),24 h后,采用qPCR法检测Fas、FasL mRNA的表达,平板克隆形成实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞克隆能力、细胞迁移与侵袭和细胞凋亡,WB法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、BAX、Bcl-2、MMP-2、PD-L1、多药耐药蛋白-1(MDR-1)及Fas、FasL蛋白表达。结果:DDP以剂量依赖的方式抑制Ishikawa和Ishikawa/DPP细胞增殖,并且与Ishikawa细胞比较,Ishikawa/DPP细胞对DDP的敏感性更低(均P<0.05);Andro以剂量依赖性的方式抑制Ishikawa/DPP细胞的增殖(均P<0.05)。Ishikawa/DPP细胞中Fas、FasL的表达水平均高于Ishikawa细胞(均P<0.05)。选取20μg/mL DDP和25μmol/L Andro为干预剂量,干预时间24h。与对照组比较,DDP组Ishikawa/DPP细胞中PD-L1、MDR-1、Fas、FasL mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而克隆形成率、迁移与侵袭细胞数、凋亡率差异均无统计学意义(均P>0.05);与DDP组比较,Andro组Ishikawa/DPP细胞中Fas、FasL mRNA表达水平、细胞克隆形成率、迁移与侵袭细胞数、PCNA、Bcl-2、MMP-2、PD-L1、MDR-1、Fas、FasL蛋白表达水平显著降低,BAX蛋白表达水平及凋亡率显著升高(P<0.05或P<0.01),pcDNA3.1-NC组与Andro组类似;与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-Fas/FasL组Ishikawa/DPP细胞上述指标变化均被逆转(P<0.05)。结论:Andro可能通过抑制Fas/FasL信号轴来抑制Ishikawa/DPP细胞增殖、迁移与侵袭,促进凋亡,从而降低细胞对DDP的耐药性。

穿心莲内酯对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌关键耐药蛋白PBP2a的抑制作用

本试验旨在为探究穿心莲内酯(andrographolide, AP)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)关键耐药蛋白青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a, PBP2a)的抑制作用。采用实时荧光定量PCR检测AP对PBP2a编码基因mecA的转录影响,通过在线软件SWISS-MODEL等对蛋白质结构进行分析,经PyMOL以及AutoDock Tools软件进行分子对接来探究AP与PBP2a结合的可能机制,运用动力学模拟来验证AP与PBP2a蛋白结合的可靠性,进一步原核表达PBP2a并制备其多克隆抗体,通过蛋白质免疫印迹检测AP作用下MRSA中PBP2a蛋白含量的变化。结果显示:64μg/mL的AP即可显著下调mecA的转录水平,AP与PBP2a蛋白的GLU170、GLU239和THR238之间可以形成稳定的氢键作用力;成功表达并纯化获得38 kDa的PBP2a蛋白转肽酶区,且制备出的多克隆抗体可以与PBP2a蛋白特异性结合;随着AP浓度的升高,PBP2a的表达量逐渐降低。总之,本研究分子模拟提示AP对PBP2a蛋白存在抑制潜力,试验结果表明AP可以通过抑制mecA的转录进而抑制PBP2a表达,从而揭示了AP使MRSA对β-内酰胺类抗生素增敏的可能机制。

穿心莲内酯介导IL-23/Th17对重症肺炎大鼠的作用

目的探讨穿心莲内酯通过介导IL-23/Th17平衡对肺炎克雷伯菌所致重症肺炎大鼠免疫功能及肺部损伤的影响及作用机制。方法建立肺炎克雷伯菌所致重症肺炎大鼠模型,随机分为模型组、穿心莲内酯低、高剂量组及阳性对照组,另设健康组。经一系列干预后,检测大鼠肺功能指标变化;脱颈处死大鼠,取双侧肺组织测量肺湿干质量比;ELISA检测大鼠血清IL-23、IL-17水平;HE染色观察大鼠肺病理学;流式细胞术检测外周血中Th17细胞比例;Western blot检测大鼠肺组织核转录因子kappaB(NF-κB)信号通路相关蛋白表达。结果模型组、穿心莲内酯低、高剂量组、阳性对照组、健康组大鼠静息通气量、气道阻力比值依次升高,肺湿干质量比与血清IL-23、IL-17水平依次降低(P<0.05)。模型组肺泡结构破坏,肺泡腔变实,可见大量炎性细胞浸润与浆液性渗出;与模型组比较,穿心莲内酯低、高剂量组及阳性对照组的肺泡结构完整性、形态均改善,炎性细胞浸润减轻。模型组、穿心莲内酯低、高剂量组、阳性对照组、健康组,大鼠外周血Th17细胞比例依次降低(P<0.05)。模型组、穿心莲内酯低、高剂量组、健康组,大鼠肺组织p-IκBα蛋白表达水平依次升高,p-NF-κB蛋白表达水平依次降低(P<0.05)。结论穿心莲内酯可通过介导IL-23/Th17平衡,增强肺炎克雷伯菌所致重症肺炎大鼠免疫功能,减轻肺部损伤,这可能与调节IκBα/NF-κB通路有关。

基于炎症模型大鼠建立穿心莲内酯抗炎作用的PK-PD模型

目的考察穿心莲内酯对炎症模型大鼠抗炎作用的药代动力学-药效动力学(PK-PD)的相关性。方法采用液质联用法测定炎症模型大鼠给药后的不同时间点穿心莲内酯的血药浓度,获取药-时曲线;采用酶联免疫检测法测定不同时间点血浆样本中炎症因子白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度,获取效时曲线。采用Phoenic 8.1软件的房室模型法对穿心莲内酯的药代动力学参数进行拟合,获得药代动力学(PK)参数;固定相关的药代动力学参数,对效时关系进行拟合,得到药效动力学(PD)参数;根据PD参数,建立穿心莲内酯的PK-PD结合模型。结果分别以IL-6、IL-1β和TNF-α为药效指标,获得穿心莲内酯的PK-PD模型分别为E=55.004-20.5445×Ce/(1.68023+Ce)、E=133.776-42.5603×Ce/(3.48303+Ce)和E=138.27-52.4122×Ce/(2.57169+Ce)。结论IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度与穿心莲内酯的质量浓度存在相关性,穿心莲内酯可通过抑制炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α来发挥抗炎作用。

穿心莲内酯对大鼠缺血性脑损伤及核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1通路的影响

目的探讨穿心莲内酯(AND)对缺血性脑损伤(IBI)的影响及其作用机制。方法将192只健康SD大鼠随机分为假手术组(Sham组),模型组(IBI组),低、中、高剂量AND组和尼莫地平(NMP)组,每组32只;采用线圈阻断大脑中动脉的方法制备IBI大鼠模型,造模完成后,低、中、高剂量AND组分别给予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的AND溶液灌胃,NMP组以10 mg/kg的NMP溶液灌胃,Sham组和IBI组给予生理盐水5 mL/kg灌胃,疗程7 d。采用Longa评分标准进行神经功能缺损评分;测定脑梗死率、脑含水量、观察梗死灶周边2 mm区域半暗带神经细胞凋亡状况、丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性,检测炎症因子含量、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)、核因子-κB(NF-κB)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果与Sham组相比,IBI组神经功能缺失评分、脑梗死率、脑含水量均显著升高(均P<0.05);梗死灶周边2 mm区域半暗带凋亡细胞数量明显增多,凋亡指数显著升高(P<0.05);MDA含量显著升高、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低(均P<0.05),肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、干扰素-γ含量显著升高(均P<0.05),Nrf2、HO-1、Bcl-2表达量显著降低而NF-κB、Caspase-3、Bax表达量显著升高(均P<0.05)。AND各组上述作用呈现一定的剂量依赖性,高剂量AND组作用最强,且高剂量AND组对各指标的作用优于NMP组(P<0.05)。结论AND对大鼠IBI具有保护作用,其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路,进而抑制氧化应激、炎症反应和神经细胞凋亡有关。

穿心莲内酯对糖尿病足大鼠血管生成的影响及机制

目的 探究穿心莲内酯(Andro)对糖尿病足大鼠血管生成的影响,并基于Hippo-Yes相关蛋白(YAP)信号通路探索其作用机制。方法 采用小剂量链脲佐菌素联合高脂高糖饮食复制2型糖尿病大鼠模型,在其建模成功的基础上,用烫伤法建立糖尿病足大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为5组,每组12只:Model组,Andro低、中、高剂量组(1、10、20 mg/kg)和抑制剂组(20 mg/kg Andro+100 mg/kg的Hippo-YAP信号通路特异性抑制剂维替泊芬)。另外取12只健康大鼠作为Control组。各组大鼠灌胃和腹腔注射溶剂或相应药物,每日1次,连续2周。给药结束后,检测大鼠创面愈合情况、空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素(FINS)含量;以HE染色法观察大鼠创面组织损伤及毛细血管数;采用流式细胞仪进行大鼠外周血内皮祖细胞(EPCs)计数;采用全自动生化分析仪检测大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量;采用Western blot法检测各组大鼠创面组织中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)及Hippo-YAP信号通路相关蛋白的表达情况。结果 与Control组比较,Model组大鼠创面愈合率,毛细血管数,EPCs比例,HDL-C含量,HIF-1α、VEGF蛋白表达水平及哺乳动物Ste20样激酶1、大肿瘤抑制基因1、YAP蛋白的磷酸化水平均显著降低,FBG、FINS水平及TC、TG、LDL-C含量均显著升高(P<0.05)。与Model组比较,Andro低、中、高剂量组大鼠上述指标均显著逆转,且呈剂量依赖性(P<0.05);维替泊芬减弱了Andro的上述逆转作用(P<0.05)。结论 Andro具有降低糖尿病足大鼠血糖、血脂,促进糖尿病足大鼠血管生成及创面愈合的作用,其作用机制可能与激活Hippo-YAP信号通路有关。

穿心莲内酯调控Nrf2/HO-1通路减轻百草枯诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化损伤

目的探讨穿心莲内酯(Andrographolide)减轻百草枯(PQ)诱导的小鼠Ⅱ型肺泡细胞(MLE-12)氧化应激损伤。方法常规培养MLE-12细胞,分为对照组、PQ组、0.1%DMSO+PQ组和穿心莲内酯+PQ组;给予25μmol·L^(-1)穿心莲内酯预处理6 h,后给予800μmol·L^(-1) PQ干预24 h。CCK-8检测细胞活性;RT-qPCR和Western blot检测Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白水平;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)水平;流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞内的活性氧(ROS)水平。结果PQ能够降低MLE-12细胞活性,并呈剂量依赖性;PQ为200μmol·L^(-1)、400μmol·L^(-1)、800μmol·L^(-1)、1200μmol·L^(-1)和2000μmol·L^(-1)对应细胞活性为89.5%、74.27%、58.65%、37.65%和26.83%。浓度为25μmol·L^(-1)及以下的穿心莲内酯对MLE-12细胞活性无明显抑制作用。800μmol·L^(-1) PQ显著降低MLE-12细胞活性(P<0.01),穿心莲内酯(5、10、25μmol·L^(-1))显著改善PQ诱导的细胞活性(P<0.01)。25μmol·L^(-1)穿心莲内酯+PQ组SOD、CAT表达水平较PQ组明显升高,而MDA和ROS较PQ组明显下降,差异显著(P<0.05)。与PQ组比较,25μmol·L^(-1)穿心莲内酯干预后Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白水平明显升高,差异显著(P<0.05)。结论穿心莲内酯能够对百草枯介导的氧化应激损伤起保护作用,机制可能与增强Nrf2/HO-1抗氧化应激通路有关。