应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的 :应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem10 4相互作用的蛋白 ,为该基因的功能研究提供线索。方法 :构建AngRem10 4的真核表达载体AngRem10 4 pGBKT7/c myc,转化酵母菌AH10 9,Westernblot证实蛋白表达 ,进行毒性和自激活检验 ,与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,筛选与AngRem10 4相互作用的蛋白。结果 :AngRem10 4蛋白能在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子 1α1、糖皮质激素受体AF 1特异延伸因子、β2 微球蛋白、巴戴 -比德尔综合征 2蛋白及 4个与细胞代谢有关的蛋白。结论 :AngRem10 4可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢 ,并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem10

AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位

构建以绿色荧光蛋白 (Greenfluorescenceprotein ,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem10 4 pEGFP N1,利用脂质体转染体外培养的COS 1细胞 ,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem10 4 EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位 ,用RT PCR和Westernblot方法验证其mRNA和蛋白的表达。结果表明在空载体pEGFP N1转染组中 ,COS 1细胞内绿色荧光呈弥散分布 ;重组质粒AngRem10 4 pEGFP N1转染组中 ,绿色荧光集中在细胞核中 ,随着表达量的增高 ,绿色荧光在细胞核中聚集成团块状、颗粒状。RT PCR的结果表明AngRem10 4在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组。Westernblot的结果也确证了AngRem10 4 EGFP融合蛋白的表达。提示新基因AngRem10 4 /pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS 1中获得了表达 ,细胞所表达的融合蛋白具有An gRem10 4和EGFP的双重活性 ,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位 ,为基因功能研究提供了线索。

新基因AngRem104对纤粘连蛋白基因上游序列的调控分析

目的:探讨新基因AngRem104对纤粘连蛋白(FN)基因启动子转录活性的影响,为揭示AngRem104对FN表达的调控机制提供线索。方法:构建了FN基因上游调控序列的系列缺失体-荧光素酶(luciferase)报告基因,瞬时转染人系膜细胞,检测报告基因的活性变化。结果:FN507-pGL3+正义AngRem104质粒转染组和FN1280-pGL3+正义AngRem104质粒转染组的luciferase相对活性较FN122-pGL3+正义AngRem104质粒转染组luciferase相对活性明显升高(P<0.01)。结论:在FN基因上游调控序列中-122到-507之间存在新基因AngRem104的正反应调控区。

新基因AngRem104与糖皮质激素受体特异延伸因子的相互作用

目的应用免疫共沉淀技术,验证新基因AngRem104和糖皮质激素受体特异延伸因子(GR-EF)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功能奠定基础。方法构建AngRem104-pcDNA3.1/V5-His和GR-EF-pCMV/c-myc融合表达载体,共转染HEK293T细胞。分别用小鼠抗人c-myc单克隆抗体和小鼠抗人V5-HRP抗体进行免疫沉淀和免疫印迹,以验证AngRem104和GR-EF蛋白间的相互作用。结果AngRem104-V5融合蛋白能够在c-myc抗体的免疫沉淀物中检测出来;在V5抗体的免疫沉淀物中也能检测到GR-EF-c-myc融合蛋白。结论新基因AngRem104和GR-EF蛋白在哺乳动物细胞中存在直接相互作用。

新基因AngRem104与Bardet-Biedl综合征2蛋白的相互作用

目的 筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白,并验证AngRem104和BardetBiedl综合征2(BBS2)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功 能奠定基础。方法 构建AngRem104的酵母真核表达载体AngRem104-pGBKT7／c-myc.用以转 化酵母菌AH109,并与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合,筛选与AngRem104相互 作用的蛋白。从中挑选Bardet-Biedl综合征2蛋白进行免疫共沉淀,构建AngRem104-pcDNA3.1／ V5-His和BBS2-pCMV／c-myc融合表达载体,共转染HEK293T细胞。分别用小鼠抗人c-myc单 克隆抗体和小鼠抗人V5-HRP抗体进行免疫沉淀和免疫印迹,以验证AngRem104和BBS2蛋白 间的相互作用。结果 以AngRem104为诱饵蛋白在人肾脏cDNA文库中共筛选到包括BBS2在 内的7个与之存在相互作用的蛋白。免疫共沉淀结果显示,AngRem104-V5融合蛋白能够在cmyc抗体的免疫沉淀物中检测出来:在V5抗体的免疫沉淀物中也能检测到BBS2-c-myc融合 蛋白。结论AngRem104和BBS2蛋自在哺乳动物细胞中存在某种相互作用,为新基因 AngRem104功能探讨和Bardet-Biedl综合征发病机制的研究提供了有价值的线索。