Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

SYBR-14/PI双染法流式细胞术检测精子质膜完整性的研究

目的:探讨应用荧光染料SYBR-14/碘化丙啶(SYBR-14/PI)双色标记法进行流式细胞术检测精子质膜完整性的可行性及其临床意义。方法:收集208例男性精液标本,按WHO精液分析标准分为正常组(n=31)与异常组(n=177)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本洗涤处理后经SYBR-14/PI双染后上流式细胞仪(FCM)分析,用发绿色荧光精子百分率(SYBR-14+/PI-%)表示质膜完整精子(PMI)的比例。结果:正常组与异常组SYBR-14+/PI-与SYBR-14-/PI+精子百分率均存在统计学差异(P均<0.05)。正常组精子SYBR-14+/PI-%为(55.66±20.64)%,显著高于异常组[(39.71±19.21)%,P=0.000]。208例标本中,SYBR-14+/PI-%与精子活动率呈显著正相关(r=0.408,P=0.000),与(a+b)级精子百分率呈显著正相关(r=0.398,P=0.000),与d级精子百分率呈显著负相关(r=-0.413,P=0.000);SYBR-14-/PI+%与精子活动率呈显著负相关(r=-0.380,P=0.000),与(a+b)级精子百分率呈显著负相关(r=-0.397,P=0.000),与d级精子百分率呈显著正相关(r=0.385,P=0.000);SYBR-14+/PI+%与精子活动率呈正相关(r=0.172,P=0.013),与(a+b)级精子百分率呈正相关(r=0.177,P=0.011),与d级精子百分率呈负相关(r=-0.164,P=0.018)。结论:应用流式细胞术SYBR-14/PI双染法检测精子质膜完整性具有可行性,可用于评估男性生育力。

CD71荧光抗体和PI染色的微核流式细胞术检测研究

目的探索CD71荧光抗体和PI染色的微核流式细胞术自动化检测方法。方法采用-85℃甲醇固定细胞,CD71荧光抗体和PI染色,以伯氏疟原虫感染小鼠血细胞为微核模式生物调校流式细胞仪,建立微核流式细胞术检测方法,并对秋水仙素(COL)诱导的小鼠外周血含微核网织红细胞进行了检测。结果所建立的方法能明确分辨外周血含与不含微核的网织红细胞和成熟红细胞,COL处理小鼠的外周血含微核网织红细胞率呈明显的剂量依赖性升高,流式细胞术与显微镜检测的外周血含微核网织红细胞率有良好相关性(r=098)。结论微核流式细胞术检测方法能准确地检测小鼠外周血含微核网织红细胞。

流式细胞术Annexin V/PI检测细胞凋亡阳性界线值及补偿值的确定

目的探讨Annexin V/PI双染方法检测细胞凋亡实验中阳性界线值及补偿值的确定方法。方法用5-氟尿嘧啶、多西紫杉醇、草酸铂抗肿瘤药物诱导胃癌细胞株BGC823凋亡,用流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,同时也检测了正常培养胰腺癌细胞株SW1990的自然凋亡率。比较了以"裸细胞"和"波谷"为依据设置阳性界线值两种分析方法对实验结果的影响;也比较了以"单染法"和"横平竖直法"确定仪器补偿值所带来实验结果的差异。结果以"裸细胞"和"波谷"为依据确定阳性界线值,两种实验数据分析方法得到的结果差异显著。"单染法"或"横平竖直法"确定的仪器补偿值相似,"横平竖直法"能进一步优化"单染法"所确定的仪器补偿值。结论Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率要以"波谷"为依据设置阳性界线值,以"横平竖直法"确定仪器补偿值。

PI/Rh123双染和流式细胞术作用下不同盐度对葡萄牙牡蛎精子质量及受精的影响

以葡萄牙牡蛎精子为对象,采用碘化丙啶(PI)/罗丹明123(Rh123)双染与流式细胞术(FCM),研究了不同盐度胁迫(10、15、20、25、30、35)对精子质量的影响,并对受胁迫精子进行授精实验。结果显示,随着盐度升高,精子的存活率、运动时间和活力先升高后降低;葡萄牙牡蛎精子的适宜盐度为20～35,活力较高的盐度范围为25～35;通过双染和FCM检测了精子质膜完整性和线粒体活性,发现盐度胁迫先对精子质膜造成损伤,后对线粒体活性造成伤害;低盐胁迫(10、15)对精子损伤严重,胁迫15 min时质膜受损比例高达67.26%±2.35%。人工授精结果显示,低盐胁迫下精子受精率和卵裂率显著降低,且卵裂阶段出现畸形及分裂停止等现象,表明精子质量不仅严重影响了受精过程,还对卵裂造成一定影响。本实验不仅探究了PI/Rh123双染和FCM检测牡蛎精子质膜完整性和线粒体活性的可行性,还结合显微观察全面评价了精子质量,为牡蛎精子质量的研究提供了理论基础。

流式细胞术定量检测细胞凋亡3种方法的比较研究

目的：探讨流式细胞术定量检测细胞凋亡３ 种方法的价值。方法：同时使用ＰＩ染色、ＴＵＮＥＬ及Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＰＩ３ 种方法定量检测地塞米松处理小鼠的胸腺细胞凋亡发生率。结果：ＰＩ染色、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＰＩ、ＴＵＮＥＬ３ 种方法凋亡检出率分别为２７．１９％ 、３２ ．２８％ 、５０ ．１７ ％ ，两两之间均有显著差异（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。但仅Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＰＩ法可将正常细胞、凋亡细胞、死亡细胞区分开来。结论：Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＰＴ法是目前最为理想的凋亡定量检测方法。

流式细胞术检测精索静脉曲张患者精子质膜完整性的研究

目的:应用荧光染料SYBR-14/PI双色标记法进行流式细胞术检测精索静脉曲张患者精子质膜的完整性并探讨其临床意义。方法:随机收集120例男性精液标本,其中90例左侧精索静脉曲张患者分为3组:VC1组(精索静脉曲张Ⅰ度,n=30)、VC2组(精索静脉曲张Ⅱ度,n=30)和VC3组(精索静脉曲张Ⅲ度,n=30),正常生育男性为正常对照组(n=30)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本经PBS洗涤处理后用荧光染料SYBR-14/碘化丙锭(PI)双染后上流式细胞仪分析,用发绿色荧光精子百分率(SYBR-14+/PI-%)表示质膜完整精子(PMI)的比例,检测精子质膜完整性,并预见精子的受精能力。结果:精索静脉曲张各组患者与正常对照组之间SYBR-14+/PI-%、SYBR-14-/PI+%均存在统计学差异(P<0.01)。精索静脉曲张患者(VC1、VC2、VC3)代表精子质膜完整性指标(SYBR-14+/PI-%)的百分率分别是:[(54.85±3.78)%]、[(45.37±4.12)%]、[(35.14±4.91)%],均显著低于正常对照组[(70.79±6.71)%],其活力顺序为VC3<VC2<VC1<对照组;120例精液标本的相关性分析表明:SYBR-14+/PI-%与精子活动率呈显著正相关(r=0.965,P<0.01),与(a+b)级精子百分率呈显著正相关(r=0.874,P<0.01),与d级精子百分率呈显著负相关(r=-0.965,P<0.01),而与pH、精液量和液化时间无显著性差异(P>0.05)。结论:应用流式细胞术SYBR-14/PI双染法能快速、准确地检测精子质膜完整性,精索静脉曲张引起精子质膜完整性下降,可能是导致男性不育的重要原因之一。

AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡的对比研究

目的通过AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡,比较两种方法的优缺点。方法以体外培养人肝细胞株HL-7702为研究对象,分别设立TGF-β1组(加入TGFβ-1至终浓度为20 ng/ml,作用72 h后收集细胞进行检测)和正常对照组(加入等量PBS),采用AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡。结果AnnexinⅤ/PI流式细胞分析显示,TGFβ-1组与正常对照组相比肝细胞的早期凋亡率和总凋亡率均显著增加[(10.55±4.71)%vs(5.98±2.97)%,P<0.01;(19.94±3.68)%vs(13.27±4.62)%,P<0.05]。TUNEL法检测显示,细胞核中有棕黄色着染者为阳性细胞,细胞呈典型的凋亡形态学改变,即表现为变小、变圆、核固缩;而正常细胞的胞核不着染。经Iimage-Pro Plus图像分析软件处理,显示TGF-β1组与正常对照组相比肝细胞凋亡率显著增加[(30.25±6.43)%vs(4.75±0.96)%,P<0.01]。结论AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法特异性高,TUNEL法灵敏度高,两种方法相结合检测细胞凋亡更准确。

应用流式细胞术快速测定细胞周期的DNA一步法

目的探索能通过流式细胞术快速测定细胞周期的方法.方法培养的小鼠成纤维细胞分别采用DNA一步法和溴化丙啶(PI)标准染色流程染色,应用流式细胞仪检测细胞G_1期、S期和G_2/M期的DNA含量,比较2种方法的测定结果.结果 2种染色方法标记的小鼠成纤维细胞呈现完整的细胞周期峰,G_1含量分别为65.85%和66.54%,S期含量分别为13.45%和13.32%,G_2/M期含量分别为20.71%和20.15%,结果差异无统计学意义(P>0.05).结论 DNA一步法能通过流式细胞术快速准确地测定细胞周期.

DC凋亡的流式细胞术分析

目的:探讨树突状细胞凋亡的流式检测方法。方法:采用Annexin V/PI双染法标记DC细胞,通过流式细胞术分析H2O2诱导产生的细胞凋亡情况。结果:本实验成功检测到细胞凋亡与死亡。结论:Annexin V与PI同时染色可成功检测DC细胞凋亡。

PI3K/AKT信号转导通路在肝癌细胞生长和黏附中的作用

目的:探讨PI3K/AKT(磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B)信号转导通路在人肝癌细胞株SMMC-7221生长和黏附中的作用机制.方法:应用LY294002作用于SMMC-7221细胞,并设对照组和实验组(LY294002:5、10、20、40μmol/L),MTT法检测LY294002作用24、48、72、96h后,对SMMC-7221细胞增殖的影响;采用肿瘤细胞-基质黏附实验检测对照组和干预组SMMC-7221黏附能力的变化;流式细胞仪检测肝癌细胞黏附分子CD44s表达情况;细胞免疫化学S-P法检测SMMC-7221细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和CD44V6蛋白表达.结果:LY294002对SMMC-7221细胞的增殖有抑制作用,呈剂量和时间依赖性;5、10mol/L的LY294002作用于肝癌细胞后与对照组相比CD44s,VEGF,CD44V6蛋白表达下降(CD44s:42.84%±6.35%,20.21%±4.5%vs89.23%±3.91%,P<0.01;VEGF:103.11±18.60,68.99±15.99vs137.84±22.50,P<0.01;CD44V6:47.33±6.15,33.09±5.23vs61.36±7.39,P<0.01);5、10μmol/L的LY294002干预后与对照组相比SMMC-7221黏附能力下降(0.498±0.024,0.407±0.029vs0.616±0.080,P<0.01).结论:阻断PI3K/AKT信号传导通路,肝癌细胞生长受到抑制、黏附能力下降.LY294002抑制肝癌细胞黏附力的作用机制与通过降低CD44V6、CD44s和VEGF水平有关.

骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡

背景:骨形态发生蛋白7可促进人髓核细胞的细胞外基质合成,减缓椎间盘退变。近年来,有学者提出其可能通过对抗髓核细胞凋亡从而发挥上述作用,但其进一步的分子机制一直未被详细阐明。目的:观察骨形态发生蛋白7对无血清诱导下发生凋亡的人髓核细胞产生的作用及其对PI3K/Akt通路的影响,分析并探讨骨形态发生蛋白7抑制人髓核细胞凋亡的分子机制。方法:通过改良Pfirrmann分级及相关条件选取12例患者获取椎间盘组织,采用酶消化法获取人髓核细胞后分组实验,以含体积分数15%胎牛血清的培养基正常培养的髓核细胞设为空白组;使用无血清培养基培养48 h诱导凋亡作为阳性对照组;在无血清条件下,通过加入不同剂量的骨形态发生蛋白7以及同时添加PI3K/Akt通路拮抗剂LY294002形成处理组和拮抗组。使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;免疫荧光观察p-Akt表达;蛋白印迹法检测Akt,p-Akt,BAD和Caspase 9等通路蛋白的表达变化。结果与结论:无血清凋亡诱导下,流式细胞术结果显示,随着骨形态发生蛋白7处理浓度上升,髓核细胞凋亡率明显下降,加入LY294002共同作用后细胞凋亡率再次升高(P<0.05)。p-Akt免疫荧光和蛋白印迹法检测结果进一步表明,与凋亡阳性对照组相比,加入骨形态发生蛋白7的实验组中,p-Akt表达明显增加,其下游凋亡相关蛋白BAD、Caspase 9蛋白表达减少(P<0.05),而在同时加入Akt通路拮抗剂LY294002后,p-Akt蛋白表达下降而凋亡相关蛋白的表达又恢复到相对较高的水平(P<0.05)。结果证明,骨形态发生蛋白7在无血清诱导的人类髓核细胞凋亡中通过激活PI3K/Akt通路,拮抗了BAD-Caspase 9相关的细胞凋亡过程,抑制了髓核细胞的退变。

Annexin V-FITC/PI法检测脂多糖诱导滋养细胞的凋亡

目的:通过流式细胞术测定法检测脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对滋养细胞凋亡的影响,明确LPS与滋养细胞凋亡的关系,为预防和治疗由滋养细胞凋亡导致的病理妊娠提供新的思路。方法:利用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的LPS处理培养的JEG-3细胞系滋养细胞的凋亡率分析。结果:流式细胞检测结果显示LPS组凋亡指数分别为(2.05±0.33)%、(7.43±0.68)%、(13.43±0.90)%显著高于对照组(0.80±0.15)%,且P均<0.01。结论:Annexin V-FITC/PI法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞;LPS能够诱导滋养细胞过度凋亡,且凋亡率随着LPS浓度的增加而增加。

黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响

目的观察黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪甲苷组和黄芪甲苷溶剂对照组。其中缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪甲苷组和黄芪甲苷溶剂对照组进行缺氧缺糖3h后再复氧复糖12 h,并于复氧复糖的同时加入黄芪甲苷。用倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果正常对照组PC12细胞贴壁生长,呈多角形,突起明显,突起之间交织成网状,细胞膜光滑且完整,胞体折光性较强。与正常对照组相比,缺氧缺糖/复氧复糖组细胞变圆或肿胀,突起回缩或消失,细胞膜破损,胞体折光性差,细胞活性明显下降(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数明显升高(P<0.05)。与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪甲苷组细胞生长状态见好转,突起较为明显,胞体折光性较好,细胞活性升高(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数下降(P<0.05)。黄芪甲苷溶剂对照组与缺氧缺糖/复氧复糖组相比无明显差异(P>0.05)。结论黄芪甲苷可减轻缺氧缺糖/复氧复糖引起的PC12细胞损伤,提高细胞活性,抑制细胞凋亡。

Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡的影响因素

[目的]探讨消化液、细胞数量及试剂温度对Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡率的影响。[方法]细胞经Accutase或无EDTA胰酶消化后比较检测结果;含有0.5×10^(5)、1×10^(5)、2×10^(5)细胞的样本按照说明书推荐(默认含有1×10^(5)细胞)加入试剂后,比较检测结果;细胞加入室温或4℃试剂后比较检测结果。以上比较均用未处理细胞和秋水仙素处理细胞分别进行。[结果]对于未处理细胞而言,与无EDTA胰酶相比,Accutase能显著减少凋亡率(2.70%vs 18.05%);而经药物处理的细胞,Accutase组凋亡率也有一定程度减少(22.32%vs 26.50%),但差异没有未处理细胞大。未处理细胞随着细胞数量的增加,PI信号并未发生明显改变,Annexin V-FITC信号与细胞数量成反比,统一十字门分析的凋亡率分别是:2.46%、1.85%、1.35%。对于药物处理的细胞差异尤其明显,统一十字门分析的凋亡率分别是:28.83%、21.27%、15.59%,因此不能用统一的十字门分析。加入4℃试剂的未处理细胞的凋亡率明显高于加入室温试剂的细胞的凋亡率(3.77%vs 8.13%),而对于药物处理的细胞,两者基本无差别(22.94%vs 22.18%)。[结论]用Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡率时,使用Accutase消化液;样本严格计数,使细胞数符合说明书要求;使用室温试剂。

X射线全身照射对小鼠骨髓细胞周期的影响

目的 研究不同剂量X射线全身照射对小鼠骨髓细胞周期的影响。方法 采用PI标记及流式细胞术(FCM)检测细胞周期的变化。结果 发现,1.0～6.0Gy X射线全身照射后12h,小鼠骨髓细胞G1及G2期明显增高,而S期明显减少;同时发现,0.05～0.2 Gy低剂量X射线全身照射后72h,G1期骨髓细胞明显减少,而S期细胞明显增高。结论 0.5Gy以上剂量X射线全身照射可诱导小鼠骨髓细胞G1及G2期阻滞,使骨髓细胞增殖明显受抑;而0.2Gy以下低剂量照射则可刺激骨髓细胞增殖。